独活寄生汤对内质网应激下软骨细胞钙稳态和凋亡的影响

摘要

目的 观察独活寄生汤在内质网应激(ERS)下对软骨细胞内钙离子(Ca2+)平衡及细胞凋亡的影响,初步探讨其防治骨关节炎的作用机制.方法 采用4周龄SD大鼠膝关节软骨建立稳定的软骨细胞体外培养体系,用甲苯胺蓝染色法对第3代软骨细胞进行鉴定.用25μmol/L的毒胡萝卜素(TG)诱导体外培养的软骨细胞产生ERS,诱导成功后给予独活寄生汤3个不同剂量(100、200、400μg/mL)孵育24 h.将细胞分为空白组、模型组、独活寄生汤低剂量组、独活寄生汤中剂量组和独活寄生汤高剂量组.分别采用倒置显微镜观察软骨细胞的形态变化;细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测各组软骨细胞活性;Hoechst 33342染色观察软骨细胞凋亡情况;双转盘激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca2+浓度实时动态变化.结果 ① 软骨细胞形态:空白组细胞形态呈单层铺路石状生长,而模型组细胞呈多角形增加,伪足增长,间隙增宽,细胞数量明显减少.独活寄生汤(100、200、400μg/mL)不同剂量组与模型组比较,细胞数量明显增多,细胞胞质均匀.② 各组软骨细胞活性:与空白组相比,模型组的存活率较低,差异具有统计学意义(P<0.05).与模型组比较,独活寄生汤各剂量组的吸光度随着浓度的升高而增高,且差异均有统计学意义(P<0.05).③ 软骨细胞凋亡情况:模型组的细胞凋亡数量显著增多,细胞核固缩程度明显,呈高密度的亮蓝色或半月形.独活寄生汤各剂量组细胞凋亡的数量明显减少,只有少量凋亡细胞呈高密度的亮蓝色或半月形,且凋亡数量随独活寄生汤的浓度增高而减少,呈一定的量效关系.④ 细胞内Ca2+浓度变化:空白组细胞的Ca2+荧光强度较弱且较均匀,呈稳定状态;与空白组比较,模型组的Ca2+释放明显增多,荧光强度增强,荧光波谱显示Ca2+火花较频繁,差异具有统计学意义(P<0.05);独活寄生汤中、高剂量组软骨细胞能较快恢复到钙稳态,且Ca2+火花明显减少;独活寄生汤低剂量组虽然仍有部分Ca2+火花,但荧光强度明显比模型组弱.结论 独活寄生汤对TG诱导的软骨细胞凋亡具有抑制作用,其作用机制可能是通过调节Ca2+平衡减轻ERS反应,从而抑制软骨细胞的凋亡.