针对增强型绿色荧光蛋白RNA干扰表达载体的构建和鉴定

摘要

目的: 构建针对增强型(EGFP)的pSUPERsiRNA(smallinterferencingRNA)表达载体,并在哺乳动物细胞COS 7细胞中观察其干扰效果.方法: 设计针对EGFP编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经BglⅡ和HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSUPER中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定.通过脂质体介导,将重组干扰质粒与pIRESE2 EG FP瞬时共转染COS 7细胞, 48h后荧光显微镜下观察干扰效果.结果: 经酶切鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中已插入了目的基因片段.瞬时共转染后荧光显微镜观察结果显示: 只转染pIRES2 EGFP及共转染pIRES2 EGFP和空载体pSUPER的COS 7细胞中有大量的EGFP表达.而共转染pIRES2 EGFP和pSUPER R237、pSUPER R304、pSUPER R447的COS 7细胞中发出荧光的细胞数量明显减少,荧光强度也明显降低.结论: 成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pSUPER R237,pSUPER R304和pSUPER R447,并与pIR ESE2 EGFP瞬时共转染COS 7细胞,有效地抑制了EGFP在哺乳动物细胞中的表达.