多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌的4个血清型

摘要

目的 建立多重PCR法检测产志贺毒素性大肠杆菌(shiga toxin-producing Escherichia coli,STEC)主要血清型O26、O145、O45和O121的分析方法.方法 根据GenBank登录序列,设计扩增O抗原翻转酶(wzx)基因的引物,建立PCR方法,并以STECO26、O145、O45和O121基因组为模板,检验多重PCR的灵敏度和特异性.使用建立的PCR,检测牛胴体表面拭子,阳性扩增条带送测序,以验证PCR扩增的可靠性.同时将阳性扩增样品,涂布显色平板,分离靶标血清型细菌.结果 本研究成功建立STEC O26、O145、O45和O121的多重PCR方法,PCR循环参数中退火温度为60℃,扩增片段分别为249、353、890和587 bp.多重PCR直接检测O26、O145、O45和O121时,最低检测限介于103～104 CFU/mL,而增菌后再检测,最低检测限均为1 CFU/mL.多重PCR用于其他血清型STEC,和非大肠杆菌扩增时,均未扩增出目的条带,只有O26、O145、O45和O121能够扩增出相应条带.当使用多重PCR直接检测胴体擦拭子时,阳性率为5.45％(3/55),主要为O26、O145血清型;增菌后检测阳性率为7.27％(4/55),主要为O26、O145和O121血清型.阳性PCR扩增样品,成功分离到O26两株、O145和O121各一株.分离菌株具有典型大肠杆菌的生化特性,携带STEC代表性毒力因子志贺毒素和紧密素,且具有多重耐药性.结论 以STECO26、O145、O45和O121的wzx基因为检测靶标,成功建立多重PCR方法,灵敏度和特异性良好,与细菌分离联合使用,可减少工作量,精准分离目的病原菌.