利用环介导等温扩增技术快速检测肠出血性大肠杆菌及其毒素的方法建立和评价

摘要

目的针对编码大肠杆菌志贺毒素由位于STEC染色体上的前噬菌体携带的stx基因和O157抗原编码基因rfbe设计特异性引物,并对反应体系和反应条件进行优化,建立一种针对肠出血性大肠杆菌及其毒素的环介导等温扩增（LAMP）反应技术检测法。方法通过优化LAMP反应的各影响因素,确定LAMP反应体系和反应条件并利用已优化的LAMP体系进行相关检测。结果确定LAMP反应体系为:内引物（FIP、BIP）与外引物（F3、B3）的比例为8∶1,Mg2+浓度10 mmol/L,dNTPs浓度1.2 mmol/L,甜菜碱浓度0.4 mol/L,Bst DNA聚合酶的添加量为1 μl。LAMP反应时间为60 min,反应温度为60 ℃。以PCR法作为对照,LAMP检测的敏感度为5×101 CFU/mL,PCR的敏感度为5×104 CFU/mL。同时,研究应用所建立的LAMP快速检测法对部分革兰阳性和阴性菌及102株O157大肠杆菌进行快速检测。结果显示,检测特异度达100%,O157大肠杆菌rfbe检出率为100%（102/102）,stx1检出率为95.2%（59/62）,stx2检出率为92.9%（52/56）。结论成功建立了一种可应用于肠出血性大肠杆菌及其毒素的敏感、特异的LAMP检测方法。