水稻源禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白两种纯化方法的建立

摘要

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)表面的一种糖蛋白,能诱导机体产生中和抗体,也是AIV主要的保护性抗原.已在水稻(Oryza sativa)胚乳中成功表达禽流感病毒H9N2 HA蛋白.为了建立水稻源禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白的纯化方法,本研究分别采用两种方法进行HA蛋白的纯化.方法一:将HA蛋白水稻粉末按照质量与体积1:5比例加入到提取液中,室温下搅拌,离心、取上清液,过滤后,首先经Q阴离子层析捕获到HA粗提蛋白,其次利用HA蛋白抗体亲和层析精细纯化HA蛋白,收集洗脱液,检测目的蛋白;方法二:用与方法一同样的方法获得HA粗提蛋白,根据Butyl疏水填料特性,HA粗提蛋白液中加入硫酸铵,搅拌、离心和过滤,进行第2步纯化,将收集到的洗脱液浓缩、换液,再经过SP阳离子层析纯化,收集洗脱液,获得HA蛋白.将两种方法纯化的HA蛋白经过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的纯度,并将HA蛋白送公司测序.结果表明,方法一:Q阴离子层析与HA免疫抗体亲和层析两种组合纯化HA蛋白的纯度约为90％左右.该组合纯化蛋白的方法相对简单,但需要培养和纯化单克隆抗体,此方法适合实验室快速小规模的蛋白纯化;方法二:Q阴离子层析、Butyl疏水层析和SP阳离子层析3种组合纯化的HA蛋白纯度达到90％左右.该方法适合建立HA蛋白的纯化工艺,用于大规模纯化HA蛋白.这两种方法获得的HA蛋白经测序与已知的氨基酸序列一致.本研究首次建立2种从水稻中获得高纯度重组H9N2亚型HA蛋白的方法,为今后制备禽流感H9N2亚型亚单位疫苗提供基础资料.