猪附红细胞体荧光定量PCR检测方法的建立及应用

摘要

根据GenBank中猪附红细胞体(Mycoplasma suis)推测的功能性基因ORF2序列设计引物和TaqMan荧光探针,经优化反应条件,建立了M.suis的TaqMan荧光定量PCR检测方法(fluorescent quantitative real-time PCR,FQ-PCR);进行了FQ-PCR检测方法的敏感性、特异性和重复性实验,并对疑似M.suis感染临床抗凝全血样品进行了应用检测,同时与普通PCR方法进行了对比实验.结果成功地建立了M.suis的FQ-PCR方法和定量标准曲线,标准曲线的曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,相关系数为0.998;FQ-PCR方法检测灵敏度可达10个拷贝/霯,比普通PCR灵敏度高100倍;FQ-PCR方法特异性高,对pGEX-T/M.suis重组质粒扩增呈现阳性反应曲线,而对8个对照细菌、病毒和寄生虫DNA扩增曲线均呈现阴性反应;不同浓度的pGEX-T/M.suis重组质粒分别重复扩增2次,重复结果良好;对24份临床疑似M.suis感染样品进行了应用检测,阳性检出率为83.3%,较普通PCR方法阳性检出率高.