柯萨奇病毒A组6型TaqMan一步法实时荧光定量PCR方法的建立

摘要

cqvip:目的建立一种灵敏、特异的一步法实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR),用于快速、准确地检测柯萨奇病毒A组6型(CV-A6)。方法利用MEGA7.0软件比对GenBank数据库中15条CV-A6 VP1序列,选择高保守区域设计特异性引物和探针;以体外转录获得的RNA为标准品,绘制标准曲线,建立检测CV-A6病毒的RT-qPCR方法;对该方法的灵敏度、特异度、重复性进行评估;并利用该方法对CV-A6病毒感染后的乳鼠组织进行病毒载量的检测。结果该方法在102~1011 copy/μL模板范围内出现良好的扩增曲线,检测极限约为102 copy/μL,标准曲线中R2系数为0.999,扩增效率为109.6%;且该方法对肠道病毒71型(EV-A71)、柯萨奇病毒A组16型(CV-A16)和柯萨奇病毒A组10型(CV-A10)均无交叉反应;另外,该方法在组间重复试验中,变异系数(CV)值小于2.0%。结论本实验建立的方法具有较强的灵敏度、特异度和重复性,可用于CV-A6病毒的日常检测、实验室诊断和定量分析。