尼古丁对BV-2小胶质细胞α7烟碱型乙酰胆碱受体、小胶质细胞P2X4受体表达和脑源性神经营养因子释放的影响

摘要

目的 观察尼古丁对BV-2小胶质α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotine acetylcholine receptor,α7nAChR)、小胶质细胞P2X4受体(P2X4 receptor,P2X4R)表达和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)释放的影响,以探讨小胶质细胞参与尼古丁所致痛觉过敏的可能分子机制. 方法 ①BV-2小胶质细胞接种在含12 mm圆形盖玻片无菌12孔板,待细胞处于对数生长期,完全随机分为2组:α7nAChR组和P2X4R组.免疫荧光标记检测α7nAChR和P2X4R在BV-2小胶质细胞上的表达.②当12孔板中BV-2细胞处于对数生长期,完全随机分为4组:尼古丁实验组(N组),尼古丁终浓度为100 μm/L;无血清培养基培养的空白对照组(C组);尼古丁拮抗剂组(NM组),10 nmol/L甲基牛扁碱(methyllycaconitine,MLA)预孵育30 min,改用含尼古丁的无血清培养基培养;单纯拮抗剂组(M组),10 nmol/L MLA预孵育30 main,改用无血清培养基培养.培养72 h后收集各组细胞.应用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测α7nAChR mRNA和P2X4R mRNA表达量的变化,Western blot检测α7nAChR和P2X4R蛋白表达量的变化.③当12孔板中细胞处于对数生长期,完全随机分为4组:正常对照组(Control组)、尼古丁预处理+DMEM组(Nicotine+DMEM组)、尼古丁预处理+激动剂组(Nicotine+ATP组),尼古丁预处理+拮抗剂组(Nicotine+5-BDBD组).其中激动剂和拮抗剂由DMEM无血清培养基稀释,在尼古丁处理72 h后加入,各组总体积保持一致,24 h后ELISA检测培养液中BDNF释放量. 结果 ①免疫荧光标记结果显示BV-2细胞存在α7nAChR和P2X4R的阳性表达.②RT-qPCR结果显示尼古丁可上调BV-2细胞α7nAChR mRNA和P2X4RmRNA的表达,α7nAChR特异性拮抗剂MLA可抑制α7nAChR mRNA和P2X4R mRNA表达的上调;Western blot结果显示尼古丁处理可使BV-2细胞α7nAChR和P2X4R蛋白的表达上调,α7nAChR特异性拮抗剂MLA可抑制α7nAChR和P2X4R蛋白表达的上调.③ELISA检测培养液中BDNF含量结果显示:Nicotine+ATP组较Nicotine+DMEM组和Control组显著增多(P＜0.05),Nicotine+DMEM组较Control组增多(P＜0.05);Nicotine+5-BDBD组较Nicotine+DMEM组和Control组显著减少(P＜0.05).结论 尼古丁可能通过α7nAChR上调小胶质细胞上P2X4R的表达进而通过BDNF的释放引起痛觉过敏的产生.