基于TLR9介导巨噬细胞极化效应探讨血管软化丸抗动脉粥样硬化的作用机制

摘要

目的:观察血管软化丸通过对TLR9调控,影响其TLR9下游信号NF-κB和IRF7水平,以及对巨噬细胞(M2/M1)极化平衡状态的影响,研究血管软化丸抗动脉粥样硬化的作用机制.方法:体外实验将巨噬细胞随机分为5组,即对照组(空白血清),血管软化丸中剂量组,血管软化丸高剂量组,IRS组(TLR9拮抗剂:IRS869),ODN组(激动剂:ODN1826).体内实验将ApoE-/-小鼠分为5组,即对照组(生理盐水,灌胃),IRS组(IRS869,腹腔注射),ODN组(ODN1826,腹腔注射),血管软化丸中剂量组(浓度为1.728 g/mL),血管软化丸高剂量组(浓度为3.456 g/mL).腹腔注射每周2次,灌胃每日1次,连续给药8周后取材进行检测.采用Western Blot法检测各组细胞TLR9的蛋白含量,主动脉TLR9及其下游分子MyD88,p-NF-KB和IRF7的蛋白含量;采用流式细胞术和免疫化学荧光检测各组细胞M1型和M2型的比例;采用RT-PCR和ELISA法检测各组细胞TNF-α的表达;采用RT-PCR法和免疫荧光检测RAW264.7细胞和动脉斑块的M1型和M2型巨噬细胞的相关标志性因子和炎症因子;病理学检测验证血管软化丸抗动脉粥样硬化的疗效.结果:与对照组RAW264.7细胞相比,各中药组和IRS组TLR9蛋白表达量明显下降(P＜0.05),ODN组TLR9蛋白表达量明显升高(P＜0.05).与对照组相比,各中药组和IRS组动脉斑块的TLR9、MyD88、p-NF-κB和IRF7蛋白表达水平均明显较低(P＜0.05).与对照组相比,ODN组M1型巨噬细胞比例相对增加,各中药组和IRS组M2型比例相对增加,差异均具有统计学意义(P＜0.05).与对照组相比,各中药组和IRS组动脉斑块中iNOS的荧光密度低表达,而CD206的荧光密度为高表达.与对照组相比,各中药组和IRS组斑块形成和面积相对较少(P＜0.05).在RAW264.7细胞实验中,中药组和IRS可逆转ODN1826引起的TNF-α的升高,使其降低(P＜0.05).与对照组比较,各中药组和IRS组斑块形成和面积相对较少(P＜0.05).结论:血管软化丸和TLR9的拮抗剂IRS869可抑制TLR9的表达,阻止其下游NF-κB和IRF7信号途径的激活,同时改变巨噬细胞极化状态(M2/M1)的平衡使其向M2型方向倾斜,能够使ApoE√-小鼠斑块面积及其斑块易损性减小.