pRPExp-AATF重组质粒构建及其在系膜细胞中的表达

摘要

目的构建抗凋亡转录因子(AATF)真核表达质粒,检测其在系膜细胞中的表达,为进一步研究奠定实验基础。方法采用PCR技术,从大鼠的肾小球系膜细胞总RNA中扩增AATF基因编码序列片段,并克隆到pRP[Exp]质粒载体中,之后对重组质粒进行酶切和测序,通过脂质转染法将细胞转染到大鼠系膜细胞中,以未转染的系膜细胞为空白对照组,转染后的为实验组,Western blot检测AATF所编码蛋白的表达水平。结果 PCR扩增产物AATF片段约1 600 bp,与理论相符;构建所得pRP[Exp]-AATF重组质粒,经双酶切琼脂糖凝胶电泳后得到约1 600 bp的条带,与预期结果相符;测序结果与Gen Bank中的大鼠AATF基因序列比对,同源性相符。经RT-qPCR证明,以未转染的系膜细胞中AATF表达水平为标准(1.00±0.00),转染后的实验组中AATF的相对表达量达(12.03±1.87),显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建pRP[Exp]-AATF重组质粒,并能在肾小球系膜细胞中正常表达,为后续研究AATF基因的生物学功能、疾病治疗和临床应用奠定了实验基础。