非洲猪瘟病毒结构蛋白p54的优化表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

摘要

为了实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)p54基因在大肠杆菌中的高效表达,同时建立以ASFV-p54重组蛋白为抗原的间接ELISA抗体检测方法,本试验根据GenBank(序列号:NC_044943.1)公布的ASFV p54的基因序列,设计一对特异性引物,扩增构建pGEX-6P-1-p54原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行复制,经IPTG诱导表达,对重组蛋白利用SDS-PAGE分析和免疫印迹鉴定正确后,进行表达条件优化,并纯化重组蛋白。随后用ASFV-p54重组蛋白为包被抗原,通过条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种稳定的血清ASFV抗体检测方法。结果显示,ASFV p54基因成功克隆到pGEX-6P-1原核表达载体中,得到pGEX-6P-1-p54原核表达质粒;转化E.coli菌株BL21(DE3)中,经诱导表达得到重组蛋白,大小为46 kDa;成功建立测定ASFV抗体的间接ELISA方法,优化后确定最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4000,经验证此方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。