不同重组病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的效率及其基因表达(英文)

摘要

背景:利用基因工程细胞进行替代治疗和基因治疗中合适的供体细胞、靶细胞以及相应载体是细胞和基因治疗最为困难的部分。目的:检测重组腺病毒Ad5和Ad5F35、腺相关病毒rAAV1/2和rAAV2、慢病毒LV对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率和外源基因表达水平,拟筛选能够高效转导骨髓间充质干细胞的载体。设计、时间及地点:细胞基因工程对照观察,于2006-10/2007-03在上海市第一人民医院中心实验室完成。材料:清洁级SD大鼠10只用于制备骨髓间充质干细胞。所有重组病毒均携带增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein,EGFP)报告基因,Ad5由本实验室制备,Ad5F35由解放军第二军医大学钱其军教授惠赠,rAAV2及rAAV1/2为本元正阳基因技术有限公司产品,LV由中科院上海生化与细胞生物学研究所郭礼和教授惠赠。方法:采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,传至第4代用于实验。按1×105/孔接种于24孔细胞培养板中,1d后细胞贴壁,设立5组:第1组向细胞培养液中加入10,100,1000MOIAd5-EGFP,第2组加入10,100,1000MOIAd5F35-EGFP,第3组加入1×104,1×105vgrAAV1/2-EGFP,第4组加入1×104,1×105vgrAAV2-EGFP,第5组加入30TULV-EGFP。Ad病毒感染2d,rAAV及LV病毒感染6d。主要观察指标:EGFP阳性表达及荧光强度。结果:Ad5-EGFP感染24h后镜下可见EGFP阳性细胞,随着病毒用量的增加EGFP阳性细胞数目增多,荧光亮度增强,12d后阳性细胞开始逐渐减少,荧光亮度减弱。Ad5F35-EGFP感染情况与Ad5-EGFP基本相似,但EGFP阳性细胞数和荧光亮度均增加。rAAV1/2-EGFP或rAAV2-EGFP感染6d后,EGFP阳性细胞数和荧光亮度均较弱。LV-EGFP感染第2天即可见少量EGFP阳性细胞,随着时间延长EGFP阳性细胞数目逐渐增多,至第6天表达EGFP荧光的细胞数量及亮度不再有明显变化。结论:腺病毒Ad5、Ad5F35与慢病毒LV能够有效感染体外培养的骨髓间充质干细胞,并表达外源基因,感染效率与病毒用量之间存在量效关系。腺相关病毒rAAV1/2和rAAV2体外感染效果不佳。