辽细辛和北马兜铃ISSR-PCR的引物筛选及反应体系的建立与正交优化

摘要

目的 探寻适合细辛和马兜铃品种鉴定的ISSR引物.方法 利用一个品种对全部100条ISSR引物设置退火温度进行梯度实验,筛选出重复性好、条带清晰的引物5条,从理论上讲,这些筛选的引物可以实现对现有辽细辛和北马兜铃品种的鉴定.马兜铃属ISSR-PCR的引物筛选,利用正交试验设计的方法,从Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度,这4种因素3个水平,对马兜铃属ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测.结果 从样品中筛选出优选引物,细辛UBC815、UBC826、UBC862、UBC868、UBC888;马兜铃UBC825、UBC827、UBC836、UBC846、UBC848.反应体系的稳定性进行检测结果均稳定可靠.结论得到马兜铃的最佳组合,即20μL ISSR-PCR反应体系中含0.25 Lmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、1×PCRbuffer、150 Lmol/L dNTP和0.5 UTaqDNA聚合酶.PCR反应条件为94℃预变性5min,以30个循环94℃变性30 s,50℃退火1min,72℃延伸1min,最后以72℃延伸10 min.得到细辛的最佳组合,20μL ISSR-PCR反应体系中含0.50 Lmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、2×PCR buffer、250 Lmol/L dNTP和2.0 UTaqDNA聚合酶;同时得到最佳模板DNA浓度为10 ng,最佳退火温度为50℃.