卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/鼠HSP70融合蛋白复性条件的研究

摘要

目的 探讨大肠杆菌表达的卵巢癌抗独特型单链抗体,小鼠热休克蛋白70(6B11ScFv/mHSP70)融合蛋白包涵体变性、复性条件,以确定其最佳体外复性条件.方法 大肠杆菌表达大量融合蛋白6B11ScFv/mHSP70:①比较不同的裂解液(8 mol/L 尿素和6 mol/L 盐酸胍)对包涵体的裂解效率及其对复性蛋白活性的影响;②探索序贯稀释方法,以及氧化还原环境和复性液中不同浓度 L-精氨酸对蛋白稀释复件的影响;③比较稀释复性和柱上复性对融合蛋白复件效率及活性的影响.采用Bradford法测定包涵体裂解液与复性后蛋白浓度.所有复性蛋白活性的检测均采用ELISA方法.结果 以包涵体形式表达6B11ScFv/mHSP70蛋白:①经6 mol/L 盐酸胍裂解包涵体的效率远高于8 mol/L 尿素,但前者复性所得蛋白活性低,6 mol/L 盐酸胍彻底裂解的包涵体经8 mol/L 尿素透析后再复性,复性效率显著提高;②序贯稀释方法可提高蛋白复性效率;加入0.5 mol/L L-精氨酸可降低稀释复性过程中蛋白聚集物的产生,提高复性效率;加入还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSH)浓度比为1:5时,可提高复性后蛋白活性;③柱上复性可一步完成蛋白的复性和纯化,所得蛋白纯度较高,但复性效率和复性后蛋白活性较稀释复性低.结论 本研究建立了6B11ScFv/mHSP70融合蛋白的最佳复性条件:包涵体经6 mol/L 盐酸胍彻底裂解后,再经8 mol/L 尿素透析,然后进行序贯稀释复性,且复性液中加入0.5 mol/L L-精氨酸和GSH:GSSH=1:5以提高复性效率和蛋白活性,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础.