非洲猪瘟病毒P30蛋白的真核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

摘要

为建立快速检测猪血清中非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的间接ELISA方法,本研究以ASFVPig/HLJ/2018株基因组为模板优化合成CP204L基因(1 bp～549 bp),构建pFastbac1-P30-His重组表达载体,利用杆状病毒-昆虫细胞真核表达系统表达ASFV重组P30蛋白(rP30),以Ni亲和纯化后的rP30作为包被抗原,经过一系列条件优化,建立了 一种快速检测ASFVP30抗体的血清学方法.结果显示,胞外分泌的rP30约为30ku,western blot鉴定结果显示其具有良好的反应原性;经优化确定了 ELISA最佳反应条件:包被量为0.4 μg/mL,待检血清稀释倍数为1∶25,血清反应时间为30min,兔抗猪IgG-HRP稀释度为1∶10 000.利用该方法同时检测猪临床常见病毒阳性血清,结果显示建立的ASFV抗体间接ELISA方法仅对ASFV感染血清检测为阳性,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪圆环病毒和猪口蹄疫病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性;将ASFV感染血清2倍倍比稀释后,利用本实验建立的ASFV抗体间接ELISA方法、ID.VET(P32)试剂盒和INGENASA(P72)试剂盒同时检测,结果显示本实验建立的方法检测灵敏度为1∶128,与INGENANA(P72)试剂盒相同,低于ID.VET(P32)试剂盒(1∶1 024);批内和批间重复性试验的变异系数均小于10％,重复性良好.利用该方法与ID.VET试剂盒同时对383份临床样品进行检测,二者符合率为98.9％.本研究建立的方法可为ASF的监测和防控提供技术支持.