鸡γ-干扰素基因的克隆及其在原核和真核系统中的表达

摘要

应用一步法逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对罗曼蛋鸡γ-干扰素基因(CHIFN-γ)进行了扩增.试验结果表明,在植物血凝素(PHA)500μg/mL、细胞浓度2.5×106/mL、诱导10 h,能从外周血淋巴细胞和脾淋巴细胞的总RNA中扩增出特异性片段.将RT-PCR产物克隆到PGEM-Teasy载体,经过限制性酶切分析、测序证实克隆到的CHIFN-γ基因正确,命名为PGEM-CHIFN-γ.序列分析表明,CHIFN-γ基因与已发表的鸡IFN-γ基因的同源性为95.6%～100%,氨基酸水平同源性为92.8%～100%,与鸭IFN-γ核苷酸同源性为67.5%.将CHIFN-γ基因克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的GST基因的下游,经IPTG诱导后表达出了43 kD的融合蛋白,超声波裂解后发现融合蛋白主要以包涵体的形式存在,裂解上清无抑制病毒活性;然而将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,通过脂质体转染COS-1细胞,用鼠抗CHIFN-γ高免血清进行间接免疫荧光试验(IFA),结果表明在COS-1细胞的细胞膜和胞浆内均有CHIFN-γ表达,且细胞病变抑制试验证实,转染后细胞培养上清有干扰素活性,在鸡胚成纤维细胞(CEF)上抑制VSV病毒的效价可达到1 024U/ml.这些结果表明真核表达系统对CHIFN-γ基因表达产物的活性有重要影响.