牛IFN-α、IFN-β及IFN-γ mRNA实时SYBR Green Ⅰ定量RT-PCR检测方法的建立及应用

摘要

为建立灵敏度高、特异性强、能够快速检测牛α-、β-、γ-干扰素(BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ)mRNA的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ基因序列,分别在其保守区内设计并合成特异引物,以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)mRNA为内参,建立SYBRGreen Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法.将BoIFN-α、BoIFN-β和BoIFN-γ cDNA分别克隆到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌DH5 α内,经PCR及测序鉴定,将得到的阳性重组质粒制备成标准品,建立SYBR Green荧光定量PCR标准曲线并分析溶解曲线,进行灵敏性、特异性和重复性试验.结果表明:BoIFN-α、BoIFN-β、BoIFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101 copies/μL～1×107 copies/μL内均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991.熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,特异性和重复性较好.本研究建立的检测牛IFN-α、IFN-β和IFN-γ mRNA的实时荧光定量PCR方法,为牛IFN mRNA水平上的定量分析奠定了基础.