TIMP1通过与CD63/整合素β1复合物相互作用并调节下游FAK/RhoA信号保护血脑屏障

摘要

目的创伤性脑外伤(TBI)是青壮年致残和死亡的首位原因。TBI后血脑屏障(BBB)明显受损,而改善BBB功能障碍、维持其完整性可能是TBI治疗的潜在策略。TIMP1参与调节血管重塑以及稳定血管通透性,但分子机制尚不明确。本研究采用整体和离体TBI模型,探讨TIMP1对TBI导致BBB功能失调的改善作用及具体调控机制,以期为TBI的临床治疗和药物研发提供更多策略。方法首先,建立TBI模型小鼠,给予rTIMP1,采用平衡木和转棒实验评估神经功能;采用伊文思兰实验评估BBB通透性。其次,利用缺氧和外源加入IL-1β,在人脑微血管内皮细胞中建立离体TBI模型,分别敲减、过表达TIMP1或外源给予rTIMP1,应用荧光素酶渗漏实验和TEER实验检测细胞屏障功能,利用生物素标记法提取膜蛋白和IF实验检测连接复合体的表达和定位。在机制探讨部分,比较rTIMP1和Ala-rTIMP1(无MMP抑制活性的rTIMP1)对内皮屏障功能的影响。最后采用Co-IP检测TIMP1与CD63/整合素β1相互作用,利用FAK抑制剂明确TIMP1调控BBB的关键通路,采用Rhotekin pulldown检测RhoA活化水平,以及应用IF检测F-actin聚集程度。结果rTIMP1可以改善TBI小鼠神经功能损伤,减少脑组织伊文思蓝渗漏和连接复合体表达缺失。敲减TIMP1增加荧光素酶渗漏、降低TEER、破坏连接复合体的表达和定位,而给予rTIMP1或过表达TIMP1均能逆转上述损伤,表明TIMP1是调控内皮屏障完整性的关键分子。rTIMP1和Ala-rTIMP1均能改善TBI小鼠神经功能损伤和内皮细胞屏障功能损伤,二者作用无显著性差异,表明TIMP1对BBB调控作用可以不依赖于其MMP抑制活性。TIMP1与CD63/整合素β1结合并激活下游FAK信号转导,FAK抑制剂可逆转TIMP1对TBI小鼠血脑屏障的保护作用以及连接复合体的调控作用,表明FAK激活是TIMP1发挥作用的关键节点。此外,TIMP1抑制RhoA活化和F-actin解聚,参与维持细胞骨架稳定性。结论TIMP1与血管内皮细胞表面CD63/整合素β1结合,以受体介导的细胞因子活性调节RhoA活化、抑制细胞骨架重构从而调控连接复合体的表达和分布,减轻BBB损伤进而在TBI中发挥保护作用。本研究提示针对TIMP1及其下游通路的干预可能是TBI治疗的潜在策略。