外源性双链RNA在蚊虫细胞中介导的基因沉默(英文)

摘要

目的　近年来 ,双链RNA介导的基因沉默 (RNA干扰 )已在许多动植物中发现 ,并成为研究基因功能的强有力的工具。为确定蚊虫细胞中是否有RNA干扰现象 ,以期为利用RNAi效应消除蚊虫抗药性研究奠定基础。　方法　设计 5′端带T7启动子的绿色荧光蛋白 (GFP)及糜蛋白酶特异性引物 ,PCR扩增目的基因获得 5′端带有T7启动子DNA片段 ,体外转录成单链RNA ,退火后形成双链RNA。转染带有GFP基因的昆虫细胞表达载体 pAct .GFP和双链RNA进入C6/ 3 6蚊虫细胞 ,72h后收集细胞 ,用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测GFP的表达差异 ,用半定量RT PCR检测GFP的mRNA的表达水平。　结果　转染糜蛋白酶基因双链RNA和 pAct .GFP质粒的细胞及仅转染pAct .GFP的细胞的GFP表达水平没有明显差异 ;转染GFP基因的双链RNA和pAct .GFP质粒的细胞的GFP表达水平显著下降 ,达 40 %～ 5 0 % ,GFP的mRNA的表达水平也相应下降了 60 %。　结论在蚊虫细胞内 ,双链RNA能特异性的抑制相应的同源性基因的表达 ,引起基因沉默 。