沉默DNA甲基转移酶1基因对子宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响

摘要

目的利用RNA干扰技术沉默宫颈癌HeLa细胞中DNA甲基转移酶（DNMT）1基因的表达,探讨沉默DNMT1基因后对HeLa细胞增殖及凋亡的影响。方法针对DNMT1基因构建短发夹状RNA（shRNA）重组载体pshRNA-DNMT1-A、B和C质粒,并行酶切鉴定和测序分析。采用RT-PCR技术筛选出其中RNA干扰效果最佳的重组载体,通过脂质体介导转染宫颈癌HeLa细胞（转染组）,以空载体组（转染空载体pSilencer3.1-H1质粒）和未转染组（未作任何处理）为对照。采用RT-PCR技术和蛋白印迹法分别检测转染前后HeLa细胞中DNMT1 mRNA和蛋白表达的变化,活细胞计数（CCK-8）法和双染法流式细胞术分别检测转染前后HeLa细胞增殖和凋亡的变化。结果 （1）酶切鉴定和测序分析证实,靶向DNMT1的3个shRNA重组载体pshRNA-DNMT1-A、B和C质粒构建成功。RT-PCR技术筛选显示,重组载体pshRNA-DNMT1-B质粒的干扰效果最佳。（2）RT-PCR技术检测显示,转染组转染24、48及72 h时HeLa细胞中DNMT1 mRNA的相对表达水平分别为0.406±0.057、0.191±0.036、0.104±0.015,明显低于空载体组和未转染组（分别为0.520±0.020、0.537±0.041,P＜0.05）。蛋白印迹法检测显示,转染组转染24、48及72 h时细胞中DNMT1蛋白的相对表达水平分别为0.197±0.024、0.075±0.015、0.040±0.013,明显低于空载体组和未转染组（分别为0.273±0.010、0.283±0.016,P＜0.05）。（3）CCK-8法检测显示,转染组转染24、48、72、96、120 h时HeLa细胞存活率分别为70.8%、64.8%、51.6%、45.3%、38.0%,分别与空载体组和未转染组各时间点比较,差异均有统计学意义（P＜0.01）。双染法流式细胞术检测显示,转染组转染24、48及72 h时的细胞凋亡率分别为（17.7±1.3）%、（35.3±1.3）%、（47.6±1.6）%,明显高于空载体组及未转染组[分别为（4.9±0.5）%、（5.1±0.7）%,P＜0.05]。结论 RNA干扰技术能成功沉默宫颈癌HeLa细胞中DNMT1基因的表达,通过下调DNMT1基因的表达可抑制宫颈癌细胞增殖、促进细胞凋亡。