质粒介导的RNAi技术对截短HCMV IE2基因表达的抑制作用

摘要

目的应用质粒介导的RNA干扰技术研究siRNA抑制截短HCMV IE2基因的表达的作用。方法以pLL3．7质粒为模板,采用半套式PCR的方法扩增出含U6启动子的siRNA表达片段,连接pMD-T simple vector构建效应质粒表达重组体pMD-T-shRNAR1和pMD-T-shRNAR2。同时采用RT- PCR方法从HCMV AD169株基因组中调取目的截短基因IE2,定向克隆到带有绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因的真核表达载体pEGFP-C1上,构建HCMV AD169株截短IE2基因重组表达质粒pEGFP- C1-IE2;用脂质体共转染效应质粒和靶基因表达重组体至Hep-2细胞中,荧光显微镜下观察效应质粒的RNA干涉作用,并观察RNA干扰的时效和量效改变。结果三组质粒重组体构建成功,克隆到的2个shRNA表达载体对截短IE2基因的表达都有干涉作用。在与靶基因质粒量比为1:1和1:2时,其中pMD-T-shRNAR1 48～72 h间干涉效应为100％,可完全封闭IE2的表达;pMD-T-shRNAR2使IE2处于极低水平表达,48-72 h间干涉效应达到98．4％～99％。结论通过质粒介导的RNAi技术能够有效地抑制HCMV IE2基因的表达,为治疗HCMV感染的药物开发提供了思路。