用于筛选和评价抑制Ⅰ型胶原α1链基因表达的抗肝纤维化药物双报告基因系统的构建及其有效性鉴定

摘要

目的构建一种双报告基因系统,用于筛选和评价抑制Ⅰ型胶原α1链基因（COL1A1）表达的抗肝纤维化药物。方法 RT-PCR克隆转化生长因子β1（TGFβ1）全长基因,酶切后插入载体pcDNA3.1和pJW4303,构建真核表达载体pcDNA3.1-TGFβ1和pJW4303-TGFβ1,以基因组DNA为模板,克隆COL1A1启动子,插入报告基因载体pGL4.29,构建含COL1A1启动子的报告基因载体pGL4.29-COL1A1 promoter。上述重组载体鉴定使用酶切和序列测定。将pcDNA3.1-TGFβ1或pJW4303-TGFβ1与pGL4-COL1A1 promoter、内参报告基因载体pRL-null共转染入肝星形细胞系LX-2中,构建转录激活的双报告基因系统。使用地塞米松鉴定该双报告基因系统评价抗肝纤维化药物的有效性。组间比较用Studant t检验分析,P＜0.05为差异有统计学意义。结果成功构建TGFβ1的两种真核表达载体和含COL1A1启动子的报告基因载体。通过双报告基因检测两种方式表达TGFβ1对COL1A1启动子活性的影响,结果表明:分泌表达的TGFβ1使COL1A1启动子活性提高200倍以上（t=21.78,P=0.0001）,非分泌表达的TGFβ1仅使COL1A1启动子活性提高了不到2倍（t=3.396,P=0.0274）。成功构建了转录激活的双报告基因系统。用COL1A1表达抑制剂地塞米松作为模式药物来鉴定该系统的有效性,结果显示地塞米松对COL1A1启动子有抑制作用,且呈有剂量依赖性。结论成功构建了用于筛选和评价抑制COL1A1表达的抗肝纤维化药物的双报告基因系统并鉴定该系统的有效性。