RAGE在高迁移率族蛋白B1调控CD4+T细胞Th1/Th2功能性分化中的作用

摘要

目的探讨晚期糖基化终产物受体（receptor for advanced glycation endproducts,RAGE）在高迁移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein,HMGB1）介导CD4+T细胞Th1/Th2功能性分化中的作用。方法体外分离、培养小鼠脾脏CD4+T淋巴细胞,将细胞浓度调整为2×10~6/L,接种至96孔培养板,0.2 mL/孔,预先加入终浓度为3μg/L的)刀豆素A（ConA）刺激12 h;依据HMGB1刺激剂量随机分成4组:对照组、10 ng/mL组、100 ng/mL组和1 000 ng/mL,分别在HMGB1刺激12 h、24 h和48 h时间点,利用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法检测白介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）表达;根据实验结果 ,在后期实验中选择100 ng/mL HMGB1刺激时间为24 h;将ConA刺激后的细胞细胞随机分成4组:对照组、A组（HMGB1刺激）、B组（HMGB1+PBS刺激）、C组（HMGB1+RAGE抗体刺激）。A、B、C组分别加入PBS稀释的终浓度为100 ng/L HMGBI工作液,对照组加入等容积的PBS液;其中B、C组在HMGBI刺激之前加入PBS液或PBS液1:200稀释的终浓度为5μg/L RAGE中和抗体孵育2 h;分别采用Westem-blot和荧光定量PCR法测定RAGE、CATA-3的表达;ELISA法检测白介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）表达,多组之间的数据比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P＜0.05为差异有统计学意义。结果与对照组（6.07±0.25）比较,100ng/mLHMGBl刺激24h（4.43±0.17）、48h（3.67±0.09）,IFN-γ/IL-4显著下降（P＜0.05）;而与对照组比较（6.34±0.42）,10 ng/mL HMGB1刺激24 h（7.65±0.19）,IFN-γ/IL-4比值显著增加（P＜0.05）,而100 ng/mL（5.10±0.19）和1 000 ng/mL HMGB1（3.31±0.12）刺激24 h IFN-γ/IL-4显著下降（P＜0.05）;与对照组比较,A组RAGE蛋白和mRNA表达显著升高（P＜0.05）;A、B组IFN-γ/IL-4比值（A组5.75±0.27;B组5.66±0.31）较对照组（7.37±0.36）明显降低（P＜0.05）,GATA3 mRNA显著升高（P＜0.05）;而C组IFN-γ/IL-4比值（6.19±0.14）较A组升高（P＜0.05）,GATA3 mRNA下降（P＜0.05）,A组与B组比较差异无统计学意义（P＞0.05）;与A组比较,B组RAGE的表达差异无统计学意义（P＞0.05）,C组明显降低（P＜0.05）,而C组较对照组RAGE的表达仍有明显增加（P＜0.05）。结论 HMGB1体外介导的CD4+T淋巴细胞向Th2功能性分化至少部分是通过过度活化RAGE/GATA3途径来实现的。