利用In-Fusion技术构建存活素-增强型绿色荧光蛋白融合基因重组慢病毒表达载体

摘要

目的:本研究以构建存活素-增强型绿色荧光蛋白(Survivin ＆ eGFP)融合基因慢病毒表达载体(p-GCFU-Survivin)为例来探讨In-Fusion克隆技术在常规载体构建中的应用价值.方法:根据In-Fusion技术原理,克隆引物设计时,在Survivin同源序列的两侧分别引入经Age I线性化的载体p-GCFU两端各15个碱基,将以此引物扩增的聚合酶链式反应(PCR)产物与线性化p-GCFU用In-Fusion交换酶在室温下作用30min,使Survivin特异性扩增产物两端的序列与线性化载体两端的序列发生同源交换,取2μl交换液进行转化,挑取阳性克隆,进行酶切和测序鉴定.将鉴定正确的阳性克隆瞬时转染293T细胞,观察Survivin ＆ eGFP融合蛋白在293T细胞中的表达.结果:每2μl克隆交换液获得大约103个克隆数,阳性率达90%以上,瞬时转染p-GCFU-Survivin可获得Survivin ＆ eGFP融合蛋白在293T细胞中的表达.结论:该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术,使基因克隆步骤简化并大大节省了实验时间和经费.