结核分枝杆菌聚合酶螺旋反应检测方法的建立及效果评价

摘要

目的 建立聚合酶螺旋反应(polymerase spiral reaction,PSR)检测结核分枝杆菌的方法并评价效果.方法 针对结核分枝杆菌插入序列IS6110设计引物进行PSR检测.提取结核分枝杆菌基因组DNA,加入BstDNA聚合酶的RM2×反应液中,在荧光定量PCR仪上于63℃反应45 min,通过荧光信号进行检测.通过对引物序列进行优化,筛选出最佳引物序列,并对其检测特异性和最低检出限进行评估.于2019年5-8月间从郑州市第六人民医院连续收集200例肺结核患者痰液样本(同一患者收集3份),对痰标本进行痰涂片、固体痰培养和PSR检测.以痰培养结果为参照,评价PSR对结核病患者的检测效能.结果 通过引物序列优化,筛选出一套对结核分枝杆菌检测的PSR引物,使用该引物进行PSR的最低检出限可达到103菌落形成单位(CFU)/ml;检测特异性实验表明该方法与15株非结核分枝杆菌无交叉反应.200例肺结核患者中,痰涂片检测阳性48例,阳性检出率为24.0％(48/200);痰培养检测阳性83例,阳性检出率为41.5％(83/200);PSR方法检测阳性87例,阳性检出率为43.5％(87/200).以痰培养结果为标准,PSR检测结核病的敏感度和特异度分别为96.4％(80/83)、94.0％(110/117),阳性预测值为92.0％(80/87),阴性预测值为97.3％(110/113),与痰培养检测方法基本一致(Kappa值为0.898).结论 PSR检测适用于结核分枝杆菌的快速筛查.