凋亡相关斑点样蛋白敲除PK-15细胞系的建立及对PRV感染的影响

摘要

本试验旨在研究凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)感染PK-15细胞的影响.以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK-15)A SC基因稳定敲除细胞系,通过T7核酸酶检测靶基因的敲除效率;CCK-8试剂盒检测PK-15敲除ASC基因对细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测PK-15以及PK15-ASC-/-细胞感染PRV-GFP 病毒的增殖差异;RT-PCR 检测PRV-gB 及 IFN-β、ISG15、IL-1βmRNA表达水平;Western blot检测PRV gE蛋白的表达;TCID50检测子代病毒感染力的滴定.结果表明:两对特异性sgRNA均能对ASC进行基因编辑,但经过T7核酸酶酶切检测进行基因编辑效率分析,结果表明,sgRNA2的基因编辑效率最高;CCK-8试剂盒检测细胞活力结果表明,PK-15以及PK15-4SC-/-细胞活力无影响;流式细胞仪检测结果表明PRV-GFP在PK15-ASC-细胞中的增殖显著低于PK-15细胞;定量RT-PCR结果表明,PRV-gB基因在PK15-ASC-/-细胞中的转录水平显著低于PK-15细胞,而IFN-β、ISG15基因在PK15-ASC/-细胞中的转录水平显著高于PK-15细胞;Western blot结果表明,PRV的gE蛋白在PK15-A SC-/-细胞中的表达显著低于PK-15细胞;滴度测定结果表明敲除ASC基因能够显著抑制子代病毒的增殖能力.本研究成功构建了PK15-ASC/-细胞系,并通过PRV感染试验证实敲除4SC基因可以抑制PRV在PK-15细胞中的增殖.