绵羊卵母细胞体外成熟过程中VEGF对DNMT3a表达的影响

摘要

旨在探究血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)在绵羊卵母细胞体外成熟过程中对DNMT3a的影响.本研究采用RNA干扰和显微注射技术将针对VEGF两个受体FLT1和KDR/Flk-1的有效干扰片段导入到绵羊卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-oocytes complexes,COCs)中,检测体外成熟培养各时间卵母细胞和颗粒细胞中DNMT3a mRNA和蛋白表达水平的变化.结果表明,COCs体外成熟培养过程中,无论是否添加VEGF,卵母细胞内DNMT3a mRNA表达量都随着培养时间延续而降低,培养至8h时DNMT3a mRNA表达量急速下降,之后下降速度放缓,至24 h后各组趋于一致,且未注射干扰片段对照组的下降速度快于其他干扰组(P＜0.01).添加VEGF组DNMT3a mRNA表达量的下降速度快于未添加组.干扰片段导入后发现,FLT1-siR-NA和KDR-siRNA复合干扰组干扰效果优于KDR-siRNA干扰组,FLT1-siRNA干扰组干扰效果最弱(P＜0.01).无论是否添加VEGF,在COCs体外成熟培养过程中,颗粒细胞DNMT3a mRNA表达量都随着培养时间延续而降低,且各组表达量差别不大.其中未注射干扰片段对照组的下降速度在COCs成熟培养中期快于其他干扰组(P＜0.05或P＜0.01),FLT1-siRNA干扰效果较好.无论是否添加VEGF卵母细胞内DNMT3a蛋白表达量从0～4 h上升,之后匀速下降,至16h急速下降,24 h为零.未导入干扰片段对照组下降速度最快.其中16 h对照组、FLT1-siRNA干扰组、KDR-siRNA干扰组和FLT1-siRNA&KDR-siRNA复合干扰组DNMT3a蛋白表达量,添加VEGF后,分别下降到培养初期的23.12％、31.07％、41.47％和37.90％,未添加VEGF的组则分别下降到培养初期的37.38％、54.60％、57.58％和82.75％.颗粒细胞中,添加VEGF组DNMT3a蛋白表达量呈现逐渐下降趋势,至20 h时,已无DNMT3a蛋白表达;未添加VEGF组从0～4 h有略微上升,之后呈现逐渐均速下降趋势,20 h时,急速下降,至24 h时,无DNMT3a蛋白表达,且干扰片段对DNMT3a蛋白表达影响不大,而本身颗粒细胞中DNMT3a蛋白表达量也不高.结果提示,绵羊COCs体外成熟培养过程中,VEGF加快了卵母细胞中DNMT3amRNA和蛋白表达量的下降速度.而干扰片段的导入则使DNMT3a mRNA和蛋白表达量下降速度放缓;颗粒细胞内VEGF的添加和受体干扰片段的导入,对DNMT3a mRNA和蛋白表达影响效果不明显.