穿心莲内酯对脂多糖刺激下大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞促凝和纤溶抑制相关因子表达的影响研究

摘要

目的明确穿心莲内酯(AD)对脂多糖(LPS)刺激下大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)表达促凝和纤溶抑制相关因子的影响。方法将对数生长期的大鼠AECⅡ细胞RLE-6TN分为正常对照(NC)组、LPS组及6.25、12.5、25 mg/L AD组(AD 6.25组、AD 12.5组、AD 25组)5组。NC组用RPMI 1640常规培养基培养;LPS组在RPMI 1640常规培养基中加入5 mg/L的LPS进行刺激;不同剂量AD组细胞分别用6.25、12.5、25 mg/L的AD处理1 h后给予LPS刺激培养。于LPS刺激细胞24 h后收集细胞及细胞培养上清液,用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)、实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分别检测细胞中组织因子(TF)、组织因子途径抑制剂(TFPI)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)的蛋白及mRNA表达;用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)、凝血酶-抗凝血酶复合物(TAT)、抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)、活化蛋白C(APC)水平。结果与NC组相比,LPS组TF、PAI-1的蛋白及mRNA表达显著升高,TFPI蛋白及mRNA表达显著降低;同时细胞上清液中PⅢP、TAT水平明显升高,AT-Ⅲ、APC水平明显降低。与LPS组相比,AD 6.25组、AD 12.5组、AD 25组TF、PAI-1的蛋白及mRNA表达均明显降低〔TF/GAPDH:0.86±0.08、0.45±0.04、0.44±0.04比1.32±0.10,TF mRNA(2^(-ΔΔCt)):2.59±0.25、2.27±0.05、1.95±0.04比4.60±0.26,PAI-1/GAPDH:2.11±0.07、1.45±0.04、0.86±0.09比2.56±0.09,PAI-1 mRNA(2^(-ΔΔCt)):3.50±0.22、2.23±0.29、1.84±0.09比6.60±0.27,均P<0.05〕,TFPI蛋白及mRNA表达明显升高〔TFPI/GAPDH:0.78±0.05、0.81±0.03、0.84±0.07比0.36±0.02,TFPI mRNA(2^(-ΔΔCt)):0.46±0.09、0.69±0.07、0.91±0.08比0.44±0.06,均P<0.05〕,细胞上清液中PⅢP、TAT水平明显降低,AT-Ⅲ、APC水平明显增加〔PⅢP(μg/L):13.59±0.23、12.66±0.23、10.59±0.30比15.82±0.29,TAT(ng/L):211.57±6.41、205.69±4.04、200.56±9.85比288.67±9.84,AT-Ⅲ(μg/L):102.95±3.86、123.92±2.63、128.67±1.67比92.93±3.36,APC(μg/L):1188.95±14.99、1366.12±39.93、1451.15±29.69比1145.55±21.07,均P<0.05〕;随着AD剂量的增加,上述促进及抑制作用越加明显,AD 25组TF、PAI-1的蛋白及mRNA表达降低、TFPI mRNA表达升高、上清液中PⅢP水平降低和AT-Ⅲ、APC水平增加与AD 6.25组比较差异具有统计学意义,且PAI-1蛋白表达降低及上清液中PⅢP水平降低与AD 12.5组比较差异也具有统计学意义。结论AD在6.25~25 mg/L的剂量范围内,能剂量依赖性地抑制LPS刺激下AECⅡ细胞RLE-6TN表达及分泌促凝和纤溶抑制相关因子,促进抗凝因子的分泌,以25 mg/L作用最明显。