细胞膜半通道蛋白Pannexin-1对肺损伤小鼠肺组织P2X7受体活性的调控作用

摘要

目的探讨细胞膜半通道蛋白Pannexin-1对肺损伤小鼠肺组织P2X7受体活化及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（caspase-1）介导的炎症反应的调控作用。方法将60只雄性C57BL/6小鼠按随机数字表法分为假手术（Sham）组、机械通气（MV）组、MV+低剂量脂多糖（LPS）组（MLL组）、MV+中高剂量LPS组（MML组）和MV+高剂量LPS组（MHL组）,每组12只。应用大潮气量MV联合气道内注射LPS的方法制备小鼠双重打击肺损伤模型。所有小鼠均行气管切开插管,Sham组小鼠保持自主呼吸,其余4组均给予28 mL/kg大潮气量MV。小鼠呼吸稳定后,Sham组和MV组经气道内注入生理盐水（NS）8 mL/kg, MLL组、MML组及MHL组分别给予2、5、8 mg/kg的LPS（以NS稀释成8 mL/kg）。MV 4 h后处死小鼠,收集支气管肺泡灌洗液（BALF）,测定细胞内外ATP浓度。取肺组织,测定肺含水率;苏木素-伊红（HE）染色后观察肺组织病理学改变,并进行肺损伤评分;采用免疫组化法观察肺组织中Pannexin-1的表达;采用蛋白质免疫印迹试验（Western Blot）及荧光定量反转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测肺组织中Pannexin-1、P2X7受体、caspase-1和白细胞介素-1β（IL-1β）的蛋白与mRNA表达。结果 Sham组小鼠肺组织无明显病理学改变;细胞内ATP浓度高于细胞外;肺组织含水率较低;免疫组化显示,肺组织中Pannexin-1呈低表达;且肺组织中Pannexin-1、P2X7受体、caspase-1及IL-1β均仅有微量蛋白或mRNA表达。与Sham组小鼠相比,MV组小鼠部分肺泡破损,渗出不明显,肺损伤评分略有升高;细胞内外ATP浓度无明显波动;肺组织含水率明显升高;肺组织中Pannexin-1、P2X7受体、caspase-1及IL-1β的表达略有升高。给予LPS干预后,小鼠肺组织渗出逐渐增多,肺泡破裂,肺泡壁毛细血管扩张,有炎性细胞趋化,肺损伤评分明显升高,但3个剂量组间无明显差异;随LPS剂量升高,小鼠BALF中细胞外ATP浓度呈递增趋势,细胞内ATP浓度呈递减趋势,肺组织含水率逐渐增高,肺组织中Pannexin-1、P2X7受体、caspase-1及IL-1β的蛋白和mRNA表达逐渐升高,均呈一定剂量依赖性。MHL组各项指标与MV组比较差异均有统计学意义[肺损伤评分（分）:8.25±0.45比3.50±0.52;细胞内ATP浓度（μmol/L）:198.76±150.77比896.69±281.11,细胞外ATP浓度（μmol/L）:336.57±90.28比141.52±42.22;肺组织含水率:（6.37±0.11）%比（5.05±0.14）%;Pannexin-1蛋白（灰度值）:3.20±0.70比1.54±0.76,Pannexin-1mRNA(2-△△CT):7.86±0.86比2.47±0.92;P2X7受体蛋白（灰度值）:3.18±0.88比1.80±0.72,P2X7受体mRNA(2-△△CT):7.17±0.96比2.31±0.45;caspase-1蛋白（灰度值）:3.00±0.45比0.93±0.51,caspase-1 mRNA(2-△△CT):4.39±0.91比2.74±0.41;IL-1β蛋白（灰度值）:2.54±1.08比1.16±0.53,IL-1βmRNA(2-△△CT):132.34±41.48比19.67±8.67,均P＜0.05]。结论 Pannexin-1在MV联合LPS诱导的肺损伤中,可能通过调节ATP由胞内释放到胞外,与细胞表面的P2X7受体结合,从而调控有活性的caspase-1生成和释放,参与IL-1β等炎性因子的生成,最终导致肺损伤的发生发展。