微小RNA-101和微小RNA-125a-5p在脂多糖诱导人THP-1巨噬细胞自噬中的调控作用

摘要

目的探讨脂多糖（LPS）诱导人THP-1巨噬细胞自噬过程中微小RNA-101和微小RNA-125a-5p（miR-101、miR-125a-5p）的调控作用。方法体外培养人白血病单核细胞THP-1,用佛波醇（PMA,50μg/L）诱导THP-1细胞48 h分化成巨噬细胞,以0、250、500、1000μg/L梯度LPS刺激细胞12h,以转染试剂脂质体Lipofectamine RNAiMAX介导miRNA模拟物（miR-mimic）转染细胞,荧光显微镜下观察miRNA的转染效率。用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测培养上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）的释放量;采用蛋白质免疫印迹试验（WesternBlot）检测细胞内自噬相关蛋白ATG4D、Beclin1、LC3Ⅱ的蛋白表达;采用定量反转录-聚合酶链反应（RT-qPCR）检测miR-101和miR-125a-5p的表达。结果①250、500、1 000μg/LPS刺激THP-1巨噬细胞12 h后,TNF-α和MCP-1释放量较未用LPS刺激细胞显著升高[TNF-α（ng/L）:1 336.1±18.5、1 340.6±24.8、1 364.5±14.9比47.6±4.4,MCP-1（ng/L）:996.3±51.3、934.6±84.3、974.2±69.5比21.3±6.5,均P＜0.01],但3个剂量组间无统计学差异。250、500、1 000μg/LPS刺激细胞12 h后,细胞内ATG4D、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达均较未用LPS刺激细胞明显上调（ATG4D的t值分别为8.i03、38.410、52.020,P值分别为0.015、0.001、＜0.001;Beclin1的t值分别为3.026、5.328、3.482,P值分别为0.047、0.034、0.037;LC3Ⅱ的t值分别为3.836、6.200、4.665,P值分别为0.018、0.003、0.010）,以500μg/L/L LPS的效果最为明显。用500μg/L LPS刺激细胞12h后,细胞内miR-101、miR-125a-5p的表达均较未用LPS刺激细胞显著下调[miR-101(2-ΔΔCt):0.68±0.08比1.95±0.26,t=8.047,P=0.001;miR-125a-5p(2-ΔΔCt):0.23±0.06比1.69±0.42,t=5.975,P=0.004]。②荧光显微镜下显示miRNA转染效率较高。Western Blot结果显示,在细胞内分别过表达miR-101或miR-125a-5p后均可引起ATG4D、Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达一定程度的下调;但同时过表达miR-101和miR-125a-5p两个miRNAs时,ATG4D、Bechn1、LC3Ⅱ的蛋白表达下调更为显著（与阴性对照组比较t值分别为14.550、5.855、14.180,P值分别为0.005、0.014、＜0.001）。结论 miR-101、miR-125a-5p能抑制LPS诱导THP-1巨噬细胞自噬,其机制可能是通过靶向调节ATG4D完成。