RUNX2基因过表达载体修饰BMSC来源外泌体联合碳酸钙支架系统在骨缺损中的应用

摘要

目的:探究RUNX2基因过表达载体修饰骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)来源的外泌体联合碳酸钙支架系统在骨缺损中的效果。方法:以兔源BMSCs为研究对象,利用流式细胞仪对BMSCs进行鉴定。构建RUNX2基因过表达载体,利用慢病毒转染BMSCs,采用超速离心法进行收集外泌体。利用透射电子显微镜观察外泌体的形态,利用Western blot法检测外泌体标志物CD63分子的表达,利用三室并联自动温控反应系统,构建碳酸钙支架。根据是否转染RUNX2基因过表达载体,将BMSCs与碳酸钙支架的复合物分成3组,即BMSCs组,RUNX2过表达组和外泌体组。利用油红O染色和逆转录-聚合酶链反应(reverse-transcription-polymerasechain reaction,RT-PCR)检测BMSCs的成骨分化。采购成年健康雄性新西兰大白兔9只,清洁级,年龄(12.97±1.21)个月,体质量(19.3±3.6)kg,每组3只。利用手术方法构建颅骨缺损动物模型,利用影像学,HE染色和Masson染色评估骨缺损的修复。结果:流式细胞仪检测结果表明,BMSCs细胞表面CD29蛋白表达为99.5%,CD44蛋白表达为100%,CD11b蛋白表达为0.1%,CD45蛋白表达为0.1%。透射电镜结果显示,外泌体为直径50~150 nm的双层膜囊泡状结构。Western blot结果显示,外泌体的分子标志物CD63表达阳性。油红O染色结果显示,外泌体组BMSCs的成骨分化要明显高于RUNX2过表达组和BMSCs组。RT-PCR检测结果显示,外泌体组BMSCs的RUNX2,BMP-2和碱性磷酸酶的mRNA相对表达量要明显高于RUNX2过表达组和BMSCs组(P<0.05)。影像学结果显示,外泌体组颅骨缺损修复效果要优于RUNX2过表达组。HE染色和Masson染色结果显示,外泌体组颅骨缺损修复效果要优于RUNX2过表达组(P<0.05)。结论:相较于RUNX2基因过表达载体转染,直接提取外泌体,可以更高效的促进BMSCs向成骨细胞分化,与碳酸钙支架相结合后,可以更好地促进骨缺损的愈合,从而为临床上骨缺损的治疗提供新思路和方法。