荧光定量PCR方法快速检测原料乳中的大肠杆菌

摘要

利用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR技术建立一种快速检测原料乳中大肠杆菌数量的方法.根据大肠杆菌的ITS保守序列设计特异性引物,应用常规PCR方法确定引物特异性,然后优化SYBR Green Ⅰ的添加量和Mg2+的额外添加量,确定对原料乳中大肠杆菌的最低检测限.结果表明,引物具有很强的特异性,最终确定的SYBR Green Ⅰ(20×)的添加量为0.75 μL,Mg2+的额外添加量为0.875 mmol/L;在不增菌的前提下,对原料乳中大肠杆菌的最低检测限为1.7×103 mL-1.检测的10份样品中有四份样品的大肠杆菌数超过103 mL-1,与平板菌落计数结果无显著差异.该方法特异性强,灵敏度高,操作简便快捷,整个检测过程仅需3 h,具有较大的推广及应用价值.