重组牛α干扰素的分泌表达及抗病毒活性分析

摘要

本研究旨在利用乳酸乳球菌构建牛α干扰素(BoIFN-α)的分泌表达系统并分析其抗病毒活性.根据乳酸乳球菌MG1363密码子使用的偏好性,对BoIFN-α基因进行优化合成.将目的基因和乳酸乳球菌表达载体质粒pAMJ399分别进行SalⅠ和BglⅡ双酶切,将胶回收产物进行连接后,转化大肠杆菌TG1感受态细胞,提取阳性质粒电转化乳酸乳球菌感受态细胞,用SDS-PAGE和Western blotting方法对表达蛋白进行分析和鉴定,同时将重组乳酸乳球菌培养28 h后取上清用PEG20000浓缩10倍左右,进行体外抗病毒试验.结果显示,试验成功构建了重组乳酸乳球菌pAMJ399-BoIFN-α/MG1363,重组菌上清和沉淀均出现约20 ku的目的条带,表明重组蛋白以分泌的形式同时存在于培养液的上清和沉淀中.浓缩后的重组BoIFN-α(rBoIFN-α)上清与水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)同时作用,用MDBK/VSV系统以微量细胞病变抑制法测定rBoIFN-α的效价为1.02×106 U/L;通过Alamer Blue法分析可知,加入rBoIFN-α后对细胞的活性影响较小;间接免疫荧光试验可见加入rBoIFN-α后细胞无绿色荧光,说明rBoIFN-α有良好的抗病毒效果;实时荧光定量PCR结果进一步证实rBoIFN-α具有一定的抗病毒效果.本试验构建了能分泌表达rBoIFN-α的乳酸乳球菌,通过一系列的体外抗病毒试验证明rBoIFN-α具有良好的抗病毒活性,试验结果为rBoIFN-α作为抗病毒药物、免疫增强剂的开发、肽类用药及临床应用提供新途径.