山羊卵巢褪黑素信号特异性载体pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT与pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A/B的构建

摘要

本研究旨在构建褪黑素(melatonin,MLT)合成酶乙酰血清素甲基转移酶(acetylserotonin methytransferase,ASMT)的卵母细胞特异表达载体GDF9-ASMT和MLT受体(MTNR1A与MTNR1B)的颗粒(黄体)细胞特异表达载体Cyp17-MTNR1A、MTNR1B,以期为进一步生产高繁殖力转基因山羊提供载体材料.首先,分别扩增出山羊生长分化因子9(GDF9)与细胞色素P450家族17亚家族A成员1(Cyp17a1)启动子序列备用;然后,扩增ASMT、MTNR1A及MTNR1B基因CDS全长序列,并通过酶切将ASMT连接至GDF9启动子下游,将MTNR1A 和MTNR1B 连接至Cyp17a1 启动子下游,制备出Pro/GDF9-ASMT、Pro/Cyp17-MTNR1A 与Pro/Cyp17-MTNR1B表达元件;最后通过酶切连接将上述表达元件整合至pcDNA3.1(+)载体中,从而构建出pcDNA3.1-Pro/GDF9-ASMT、pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1A 和pcDNA3.1-Pro/Cyp17-MTNR1B 真核表达载体.经测序验证,本研究扩增出的GDF9和Cyp17a1启动子长度分别为2 496和2 497 bp,与GenBank数据库中山羊GDF9和Cyp17a1基因起始密码子上游2 500 bp区域的同源性均为98％;扩增出的ASMT、MTNR1A与MTNR1B的CDS序列长度分别为1 037、1 100和1 130 bp,与GenBank所递交的标准序列同源性分别为98％、98％和99％,氨基酸序列同源性分别为97％、98％和99％.上述载体的成功构建可为进一步生产褪黑素高繁殖力转基因山羊提供参考.