非洲猪瘟病毒P30蛋白原核表达及间接ELISA检测方法建立

摘要

【目的】建立快速、准确检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法。【方法】根据GenBank收录的ASFV分离株全基因组中的CP 204 L基因序列,在不影响氨基酸序列的前提下进行密码子优化,克隆到pCold TF冷休克表达载体,构建重组质粒pCold TF-p30。利用大肠杆菌原核表达系统进行IPTG诱导表达并对诱导时间和诱导浓度进行优化。用His标签镍柱对重组蛋白P30进行纯化,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用纯化后的P30重组蛋白作为抗原,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法并对反应条件进行优化,检验该方法的特异性、灵敏性和重复性,并用该方法与商品化试剂盒进行对比。【结果】重组质粒成功转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后以可溶性蛋白形式表达,在约82 ku处有目的蛋白特异性条带。当16℃诱导12 h时蛋白表达量最高,不同IPTG浓度诱导无明显差异。Western blotting结果显示,P30重组蛋白可与ASFV阳性血清产生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。建立的ASFV抗体间接ELISA检测方法抗原最佳包被浓度为1μg/mL,使用1%BSA溶液封闭效果最佳,血清最佳稀释度为1∶600,酶标二抗最佳工作浓度为1∶8000,该方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,与商品化试剂盒总符合率达到96.7%。【结论】本试验成功表达并纯化了ASFV的P30蛋白,建立了ASFV抗体间接ELISA检测方法,为非洲猪瘟的监测、诊断及试剂盒开发提供了参考。