重组慢病毒LV5-NE的构建及NE促进NB4细胞增殖

摘要

目的 构建重组慢病毒LV5-NE筛选纯NB4/LV5-NE细胞株,探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4增殖的影响,为研究NE致白血病的可能机制奠定基础.方法 以质粒pCMV-myc-NE为模板得到PCR产物NE,将NE基因连接到穿梭载体pGLV10/U6/GFP/Puro后酶切验证,将序列正确的质粒与包装质粒pGag/Pol、pRey、pVSV-G共转染293T细胞.测定病毒滴度.实验分为空白组、LV5-NC组和LV5-NE组,病毒感染NB4细胞72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞.用Westemblot检测NE在NB4细胞中的蛋白表达以及其切割作用;CCK-8法观察NB4细胞增殖能力;流式细胞术测定NB4细胞周期和凋亡;Western blot检测pAkt和Akt以及Bax和Bcl-2蛋白表达.结果 成功构建表达NE的慢病毒LV5-NE,筛选得到纯NB4/LV5-NE细胞株,NE对NB4细胞的增殖有明显促进作用(P＜0.05)结论NE在NB4细胞株中稳定表达后中可促进NB4细胞的增殖,其增殖作用可能通过激活PI3K/Akt通路调节.