(R)-专一性羰基还原酶与甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达

摘要

[目的]通过研究-专一性拨基还原酶和甲酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的共表达,解决较高底物浓度下不对称转化反应的辅酶限制性问题.[方法]分别以近平滑假丝酵母(candida parapsitosis CCTCC M203011)和博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)基因组为模板,采用PCR方法扩增得到(R伏)-专一性拨基还原酶基因(rcr)和甲酸脱氢酶基因(fdh),克隆到共表达载体pETDuetTM-1中进行表达.共表达质粒 pETDuet-rcr-fdh转化稀有密码子优化型菌株E.coli Rosetta,获得重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rcr-fdh.结果 在30℃ 条件下,经1mmol/L IPTG诱导表达8h后,SDS-PAGE结果表明-专一性拨基还原酶和甲酸脱氢酶均有明显的表达,其相对分子质量分别为37kDa和40kDa.以高浓度(6glL)2一经基苯乙酮为底物时,0.19重组菌细胞催化产生(R)-苯基乙二醇,产物光学纯度为100% e.e.,产率为85.9%.与无甲酸脱氢酶参与辅酶再生循环的重组菌E.coli Rosetta/pETDuet-rrc;相比,产物光学纯度和产率分别提高了1.3和2.7倍.讨论 该重组菌的构建为基因工程法生物合成(R)-苯基乙二醇的工业应用奠定了基础.