棉铃虫蜕皮调节转录因子在大肠杆菌中的重组表达及其包涵体纯化

摘要

蜕皮调节转录因子(hormone receptor 3,HR3)在昆虫蜕皮过程中启动蜕皮相关早期基因簇表达,并抑制蜕皮相关晚期基因簇表达,对昆虫蜕皮级联反应起着关键的调控作用.利用合成的特异性引物通过RT-PCR扩增了棉铃虫Helicoverpa armigera蜕皮调节转录因子(HHR3),并与pGEX-4T-1载体连接,在大肠杆菌Escherichia coli DH5α内进行扩增,经过PCR筛选获得了HHR3-pGEX-4T-1重组质粒.用该质粒转化大肠杆菌表达菌株BL21并进行诱导表达,获得了与谷胱甘肽-S转移酶(GST)融合表达的HHR3包涵体,分子量在94 kD左右,通过无离子去垢剂CAPS(3-[cyclohexylamino]-1-propanesulfonic acid)变性、复性后获得了可溶性GST-HHR3融合蛋白,经凝血酶裂解和SDS-PAGE分离得到纯化的HHR3,经蛋白质N-端测序确认表达正确.用重组表达的HHR3免疫家兔,制备了兔抗HHR3多克隆抗体,免疫印迹检测显示该抗体对HHR3有特异性识别能力,可以用于HHR3功能与调控等下游研究.免疫印迹检测结果还表明,HHR3在5龄向6龄蜕皮的幼虫脂肪体中高表达,在进入6龄24 h的幼虫脂肪体中含量明显下降,在6龄72 h的幼虫中肠中没有检测到HHR3表达;成虫卵巢中有HHR3表达.