Modeling Neuropathological Type II Gaucher Disease Using iPSCs, CRISPR/Cas9 and Transcription Factor-Driven Protocols

摘要

A Doen?a de Gaucher (GD) é uma patologia com transmiss?o hereditária autossómica recessiva causada por muta??es no gene GBA1 que codifica para o enzima beta-glucocerebrosidase (GCase). Esta proteína é um enzima housekeeping nos lisossomas, responsável pela degrada??o de glucocerebrosidase em glicose e ceramida. Com uma incidência entre 1 em 40.000 e 1 em 60.000 nascimentos na popula??o geral, e 1 em 800 nascimentos na popula??o de descendência Judaica Ashkenazi, é a forma mais comum de Doen?a Lisossomal de Sobrecarga. Est?o descritas mais de 495 muta??es no gene GBA1, sendo as mais comuns muta??es missense que levam à produ??o de proteínas misfolded. Em homozigotia ou em heterozigotia composta, certas muta??es levam à manifesta??o de fenótipos mais severos com envolvimento neurológico, em que a atividade da GCase é quase nula, classificado como GD do tipo 2. Independentemente do nível de manifesta??o da doen?a, as muta??es no gene GBA1 est?o associadas a um maior risco de desenvolvimento de Doen?a de Parkinson e Demência de Corpos de Lewy, através de mecanismos ainda desconhecidos, mas muito provavelmente relacionados com a degrada??o ineficiente de proteínas, nomeadamente α-sinucleína, em células com funcionamento lisossomal comprometido. Modelos animais têm sido gerados para o estudo de GD, e, embora bastante úteis para as manifesta??es somáticas desta patologia, o envolvimento neurológico tem sido muito limitado nestes modelos e as muta??es induzidas em homozigotia levam a fenótipos agressivos em que os animais n?o sobrevivem muito tempo após o nascimento, pelo que a sua aplica??o no contexto de GD do tipo 2 é bastante insuficiente. Neste sentido, as iPSCs produzidas através da reprograma??o direta de células somáticas humanas obtidas de pacientes, a um estadio de pluripotência via o método desenvolvido por Yamanaka, et al, surgem como um possível modelo in vitro, possibilitando o estudo de diversas patologias. Através de métodos de edi??o genética como CRISPR/Cas9 e da sua otimiza??o nos últimos anos, é possível a introdu??o, dele??o ou corre??o de muta??es nestes modelos celulares, de forma a replicar doen?as hereditárias ou obter controlos isogénicos que permitem o seu estudo de forma fidedigna. Inicialmente neste projeto, caracterizámos células iPSCs provenientes de três pacientes com a forma mais severa e com manifesta??es neuropáticas de GD tipo 2. Através de RT-qPRC, da forma??o de corpos embrionários e cariotipagem, demonstrámos a estabilidade cromossómica nas amostras em estudo e o seu estado de pluripotência através da express?o de genes como NANOG, SOX2 e OCT4 (POU5F1), bem como a posterior diferencia??o dos corpos embrionários nos três folhetos germinativos: endoderme, mesoderme e ectoderme. Seguidamente, trabalhámos na otimiza??o de protocolos de edi??o genética com CRISPR/Cas9 com o intuito de corrigir as muta??es missense de substitui??o de bases no gene GBA1 das amostras em estudo, de forma a obter controlos isogénicos e, através da sobre-express?o de fatores de transcri??o, induzimos a diferencia??o das iPSCs em neurónios e astrócitos. Finalmente, demonstrámos níveis significativamente reduzidos de atividade enzimática da GCase nas linhas mutadas e altera??o do funcionamento dos lisossomas, quando comparadas a controlos wild type e ao controlo isogénico e fun??o lisossomal alterada, nas Gabriela ras de GD tipo 2. De uma forma geral, este estudo demonstrou o potencial significativo da utiliza??o de células iPSCs como modelos in vitro de GD, particularmente da forma neuropática, em que a obten??o dos tipos celulares afetados é particularmente difícil e n?o existem, até à data desta disserta??o, modelos animais que repliquem este fenótipo.