猪流行性腹泻病毒经典株和变异株荧光定量RT-PCR双重检测方法的建立及应用

摘要

猪流行性腹泻(Procine epidemic diaherra,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Procine epidemic diaherra virus,PEDV)引起的一种在养殖场中常见的疾病。其主要特点包括急性、高度接触性、高死亡率,是一种高发的病毒性肠道传染病。这种疾病的特征表现为发病急,传染性强,死亡率高,对养殖场会造成重大损失。目前在对其诊断时常用的方法包括酶联免疫法、免疫组化、RT-PCR等。这些方法虽然可满足应用要求,不过也存在如检测相对费时、灵敏度不高、难以早期诊断的问题。应用荧光定量RT-PCR诊断方法可以进行高通量定量检测,并且能够较好的弥补上述所提到的缺陷。根据检测结果表明目前国内PEDV的流行株大部分属于变异株,这对疫苗防控产生不利影响。因而在这种疾病的防控方面,有必要对PEDV经典株株和变异株进行准确区分。不过由于各方面因素影响,现有的PEDV检测技术还不能满足这方面区分要求。本研究基于S基因序列,设置了相应的引物和探针,在一定优化基础上研发出改进的RT-PCR技术,用于高效准确的鉴别PEDV经典株和变异株,同时通过对比分析验证这种检测方法的特异性和敏感性。结果显示:经典株的标准曲线方程表达式为Ct=-3.192×log copies+38.53,相关系数R2为-0.999,变异株的标准曲线方程表达式为Ct=-3.286×log copies+39.10,相关系数R2为-1.000;该方法特异性强,可以很好区分PEDV与其它病毒核酸,可检测PEDV的最小浓度可达1×101copies/μL;且方法重复性稳定。对获得的119份疑似PEDV样本通过这种方法鉴定,确定出71份阳性,对应的阳性率为59.67%。其中经典株9份,经典株阳性率7.56%;变异株62份,变异株阳性率52.10%。对检出的1份经典株PED-sampleC1和2份变异株PED-sampleV1/PED-sampleV2的扩增产物经测序后对比序列发现,经典株PED-sampleC1与经典株JS2008同源性最高,为99.6%,而与变异株的同源性均小于95%;变异株PED-sampleV1与变异株YC2014的同源性最高,为99.4%,PED-sampleV2与变异株AH2012的同源性最高,为99.1%,变异株PED-sampleV1/PED-sampleV2与经典株(JS2008、CV777和LZC)的序列同源性均小于95%。由此可判断本文所建立的方法能够鉴别区分PEDV经典株和变异株,此研究为临床快速诊断PEDV感染提供了一种新的方法。

目录

摘要

ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 PEDV的病原学特点

1.1.1 PEDV的形态及理化特征

1.1.2 PEDV的分类

1.2 PEDV的分子生物学特点

1.2.1 PEDV 的 S 基因与 S 蛋白特征

1.2.2 PEDV 的 E 基因与 E 蛋白特征

1.2.3 PEDV 的 M 基因和 M 蛋白特征

1.2.4 PEDV 的 N 基因和 N 蛋白特征

1.2.5 PEDV 的 ORF3 基因及其蛋白特征

1.2.6 PEDV 的 ORF1 基因及其特征

1.3 PEDV的流行病学特点

1.4 PEDV的临床症状与病理变化

1.5 PED的防控措施

1.5.1 PEDV灭活疫苗

1.5.2 PEDV弱毒疫苗

1.5.3 PEDV基因工程疫苗

1.6 PEDV的实验室诊断

1.6.1 病原学诊断方法

1.6.2 免疫学诊断方法

1.6.3 分子生物学诊断方法

1.7 本试验的研究目的及意义

第二章 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 病毒、病料

2.1.2 主要仪器

2.1.3 主要试剂及试剂盒

2.1.4 主要配制试剂

2.2 方法

2.2.1 引物的设计与合成

2.2.2 病料处理和核酸提取

2.2.3 PEDV经典株和变异株阳性模板的制备

2.2.4 PEDV 荧光定量 RT-PCR 方法的建立和条件优化

2.2.5 临床样品检测分析

第三章 实验结果与分析

3.1 PCR扩增产物和重组质粒标准品的鉴定

3.2 PEDV 荧光定量 RT- PCR 双重检测方法的反应体系优化

3.3 PEDV 荧光定量 RT- PCR 双重检测方法的标准曲线建立

3.4 PEDV 荧光定量 RT- PCR 双重检测方法的特异性试验

3.5 PEDV 荧光定量 RT- PCR 双重检测方法的敏感性试验

3.6 PEDV 荧光定量 RT- PCR 双重检测方法的重复性试验

3.7 PEDV 荧光定量 RT- PCR 双重检测方法的检测标准

3.8 临床样品检测分析

3.9 讨论

第四章 结论

参考文献

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