10种中药提取物的抗氧化作用及ESR波谱研究

摘要

氧自由基(oxygen free radicals,OFR)又称活性氧,包括超氧阴离子自由基(O2·)、羟基自由基(OH·)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(1O2·)、脂氧自由基(RO·)、脂过氧自由基(RDO·)、NO等。氧自由基与多种疾病密切相关,因此,预防或减少体内的氧自由基损伤,从而减少疾病的发生是人们一直期待解决的问题。传统合成的抗氧化剂虽然抗氧化能力比较强,但长期食用有潜在的毒性,有的甚至会产生致畸、致癌作用,因此愈来愈受到人们的排斥。因而寻找天然、高效、低毒的中草药抗氧化剂成为了一种必然趋势。因此,本项研究从体内和体外两个层次,以抗氧化为切入点,采用不同的氧化损伤模型,观察10种中药(黄芩、红花、茶叶、贯叶金丝桃、槐米、木蝴蝶、金荞麦、金银花、山楂叶、山楂鲜果)的抗氧化作用,为临床应用提供科学依据。
　　 1.黄芩、红花水提取物对快速老化小鼠衰老模型的抗氧化作用的影响
　　 选取快速老化模型小鼠P/8(SAM-P/8),观察黄芩、红花水提物对快速老化小鼠的保护作用。实验共分5组:空白对照组,阳性药对照组,黄芩水提物组(7.6,3.8,1.9 g生药·kg-1)、红花水提物组(7.6,3.8,1.9 g生药·kg-1)剂量组,连续给药4周,末次给药1小时后取胸腺和脑称重测脏器系数；分别测定脑匀浆和血清中MDA,SOD,CAT和GSH-Px水平。实验结果表明:黄芩、红花水提物显著降低衰老小鼠的胸腺系数和脑系数,还可不同程度的提高衰老小鼠体内SOD、GSH-Px、CAT活性,抑制MDA含量的升高,提示黄芩、红花水提取物可能是通过提高机体的抗氧化能力达到抗衰老的作用。
　　 2.黄芩等10种中药醇提物对Fe2+-ADP-NADPH所致肝微粒体脂质过氧化的影响低温条件下制备大鼠肝微粒体,观察黄芩等10种中药醇提物对Fe2+-ADP-NADPH氧化体系诱发的脂质过氧化的抑制作用,通过计算半数抑制浓度评价上述10种中药醇提物的抗氧化作用。结果表明,10种中药提取物及标准品(水溶性的维生素E-Trolox)在一定浓度时可明显抑制体外Fe2+-ADP-NADPH氧化体系所致大鼠肝微粒体MDA的生成,且在一定浓度范围内呈现剂量-效应关系,标准品、黄芩、红花、茶叶、贯叶金丝桃、槐米冷浸、槐米回流、木蝴蝶、金养麦、金银花、山楂叶、山楂鲜果的IC50分别为0.014、0.066、0.598、0.030、0.041、0.041、0.058、0.098、0.324、0.4.58、1.069、6.156 mg·mL-1,抗脂质过氧化活性由大到小依次为标准品>茶叶>槐米冷浸>贯叶金丝桃>槐米回流>黄芩>木蝴蝶>金荞麦>金银花>红花>山楂叶>山楂果；其中,Trolox有较强的抑制脂质过氧化作用,山楂果的脂质过氧化抑制作用较弱。
　　 3.黄芩等10种中药醇提物对ox-LDL所致心肌微血管内皮细胞损伤的影响
　　 采用第三代大鼠乳鼠心肌微血管内皮细胞,观察黄芩等10种中药醇提物及Trolox预处理对ox-LDL诱导损伤的心肌微血管内皮细胞的保护作用。实验分5组,空白对照组:正常完全培养基培养；模型对照组:加入ox-LDL(100μg·mL-1)孵育24 h；提取物大、中、小剂量组:分别加入不同浓度的提取物预处理24 h,然后换为100μg·mL-1的ox-LDL溶液孵育24 h。所有细胞均在37℃,95％O2+5％CO2,饱和湿度条件下的二氧化碳培养箱中培养。实验结束后分别收集细胞上清液测定MDA,SOD和GSH-Px活性。实验结果表明:10种中药醇提物及Trolox预处理能明显提高ox-LDL损伤的内皮细胞存活率,减少MDA含量,提高SOD,GSH-Px活性。结果提示10种中药醇提物对ox-LDL,损伤的心脏微血管内皮细胞具有不同程度的保护作用,其机制可能与直接减少自由基生成,增强其清除以及增强内源性抗氧化酶的活性有关。
　　 4.黄芩等10种中药醇提物对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶所致心肌细胞氧化损伤的影响
　　 采用原代培养的乳鼠心肌细胞,建立心肌细胞黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧化损伤模型,观察10种中药醇提物及Trolox对心肌细胞黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧化损伤的保护作用。实验分5组,空白对照组:正常普通培养基培养；模型对照组:换为4.2mmol·L-1的黄嘌呤与280U·L-1的黄嘌呤氧化酶孵育6h；提取物大、中、小剂量组:分别加入不同浓度的提取物的同时加4.2mmol·L-1的黄嘌呤与280U·L-1的黄嘌呤氧化酶作用6 h。所有细胞均在37℃,95％O2+5％CO2,饱和湿度条件下的二氧化碳培养箱中培养。实验结束后分别收集细胞上清液测定LDH,MDA,SOD和GSH-Px活性。实验结果表明:10种中药醇提物及Trolox对能明显提高黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧化损伤的心肌细胞存活率,减少LDH,MDA含量,提高SOD,GSH-Px活性。结果提示10种中药醇提物对心肌细胞黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧化损伤具有保护作用,其机制可能与直接减少自由基生成,增强其清除以及增强内源性抗氧化酶的活性有关。
　　 5.茶叶、槐米冷浸、木蝴蝶醇提物对ox-LDL损伤心肌微血管内皮细胞和黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶损伤心肌细胞中自由基信号的影响
　　 采用原代培养的心肌微血管内皮细胞和乳鼠心肌细胞,建立心肌微血管内皮细胞ox—LDL损伤模型和心肌细胞黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶氧化损伤模型,观察茶叶、槐米冷浸、木蝴蝶醇提物对内皮细胞和心肌细胞中自由基信号的影响。实验分组同前,所有细胞均在37℃,95％O2+5％CO2,饱和湿度条件下的二氧化碳培养箱中培养。实验结束后收集细胞悬液应用电子自旋波谱仪测定活性氧自由基信号。实验结果表明,茶叶、槐米冷浸、木蝴蝶醇提物能够不同程度的降低细胞悬液中自由基信号的峰值。结果提示,茶叶、槐米冷浸、木蝴蝶醇提物减轻细胞氧化损伤的作用可能也是通过减少自由基产生,增强其清除而实现的,与前期实验结果有一致性。
　　 综上,黄芩、红花水提物在整体动物模型,对快速老化小鼠具有一定的抗衰老作用,黄芩等10种中药醇提物在Fe2+-ADP-NADPH所致肝微粒体脂质过氧化模型、微血管内皮细胞ox-LDL损伤模型、心肌细胞黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶损伤模型等3个模型上,均可提高细胞上清液中的SOD,GSH-Px活性,降低MDA的含量,通过ESR检测,发现茶叶、槐米冷浸、木蝴蝶还可直接减少自由基的产生,增强其清除而达到抗氧化的作用。结果提示黄芩等10种中药提取物具有抗氧化作用,其机制与减少自由基生成,增强其清除,增强内源性抗氧化酶的活性,减少氧化产物生成等有关。

目录

文摘

英文文摘

合作项目

英文缩写附录

实验设计示意图

文献综述

1 氧化应激的概念

2 氧自由基的来源

3 氧自由基与信号转导

4 氧化应激与衰老

5 氧化应激与心肌缺血再灌注损伤

6 氧化应激与动脉粥样硬化

7 中药防治心脑血管疾病的研究

前言

实验研究

第一章 黄芩、红花水提物对快速老化小鼠的抗氧化作用的影响

1 材料

2 方法

2 结果

3 讨论

第二章 黄芩等10种中药醇提物对FE2+-ADP-NADPH所致肝微粒体脂质过氧化损伤的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 黄芩等10种中药醇提物对OX-LDL所致心肌微血管内皮细胞损伤的影响

1 大鼠乳鼠心肌微血管内皮细胞原代培养方法的建立

1.1 材料

1.2 方法

1.3 结果

1.4 讨论

2 氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)造模浓度的确定

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

3 黄芩等10种中药醇提物对ox-LDL损伤的心肌微血管内皮细胞的影响

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 黄芩等10种中药醇提物对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶所致心肌细胞氧化损伤的影响

1 大鼠乳鼠心肌细胞原代培养方法的建立

1.1 材料

1.2 方法

1.3 结果

1.4 讨论

2 黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶造模浓度的确定

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果

2.4 讨论

3 黄芩等10种中药醇提物对黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶损伤心肌细胞的影响

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果

3.4 讨论

第五章 茶叶、槐米冷浸、木蝴蝶醇提物对OX-LDL损伤心肌微血管内皮细胞和X/XO损伤心肌细胞中自由基信号的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

结论

综述参考文献:

实验研究参考文献:

致谢

个人简历