apo CⅢ增强子在染色质水平上调控人载脂蛋白apoAI/CⅢ/AⅣ/AV基因簇的机制研究

摘要

在真核基因的表达调控机制中，染色质水平的调控占极其重要地位。由于染色质结构变化可以在细胞传代过程中记忆下来从而成为表观遗传的一部分。染色质水平的调控主要包括ATP依赖的染色质重塑和组蛋白的共价修饰两方面。组蛋白修饰可以影响染色质的开放或关闭，进而对基因的表达起调控作用。其中组蛋白H3、H4的乙酰化修饰和组蛋白H3K4甲基化修饰代表了具有转录活性的开放染色质结构。根据组蛋白修饰的分布范围，染色质开放分为位于基因顺式元件的局部染色质开放，和跨越增强子区、启动子区以及基因间区的大范围染色质开放。大范围的疏松染色质结构有利于基因发生活跃转录。增强子与启动子的相互作用可能参与了染色质大范围开放结构的形成。用RNA-TRAP及染色质构象捕获实验(ChromosomeConformationCapture，3C)已证实，远距离相互作用的增强子与启动子在空间上靠近，通过顺式元件和反式因子间的DNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用形成环状结构。成环机制、链接机制和滑动机制则是环状结构形成的可能方式。有研究提示基因间转录不仅可能与染色质大范围开放有关，而且可能参与增强子沿DNA链滑动、并最终和启动子相互作用的过程。 载脂蛋白apoAⅠ/CⅢ/AⅣ/AⅤ基因簇(apoAⅠ基因簇)在脂质代谢中起重要作用，它的异常表达与血脂代谢紊乱以及动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展密切相关。该基因簇上的apoCⅢ增强子作为共调控元件，介导了apoAⅠ、apoCⅢ、apoAⅣ基因的肝、肠组织特异性表达，但不调控簇内的apoAⅤ基因。近年来的研究表明，组蛋白修饰等表观遗传因素参与了肿瘤、心血管疾病等与环境因素密切相关的疾病的发病过程。但在apoAⅠ基因簇，对DNA顺式元件、参与调控的转录因子以及相关信号通路的研究较多，对其染色质水平的调控机制尚无报道。本研究在染色质水平上对载脂蛋白apoAⅠ/CⅢ/AⅣ/AⅤ基因簇的表达调控机制、主要是apoCⅢ增强子对此基因簇的调控机制进行研究。 由DNA-蛋白质作用介导的增强子与启动子相互作用是基因在DNA水平上的调控方式之一。DNA水平上的调控反映了两个顺式元件在特定的细胞环境下发生作用的可能性。我们构建了apoCⅢ增强子与apoAⅤ启动子相连的荧光素酶报告基因载体，用瞬时转染的方法观察当apoCⅢ增强子与apoAⅤ启动子在空间上靠近时的调控作用。结果发现，在体外实验中，apoCⅢ增强子对apoAⅤ启动子具有转录增强作用。而我们实验室先前的工作基础显示，apoCⅢ增强子在体内不调控apoAⅤ的表达。 考虑到这种体内实验与体外实验结果的差别可能与apoAⅠ基因簇的染色质结构有关，我们先在HepG2、Caco-2、HeLa细胞系，用染色质免疫沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)方法观察这个基因簇上代表开放染色质结构的组蛋白H3乙酰化、H3K4甲基化修饰状况及其与基因转录的相关性，进而在人apoAⅠ基因簇转基因小鼠的正常株系和增强子删除株系之间比较组蛋白修饰的差别，以期了解增强子对组蛋白修饰的影响。来自HepG2、Caco-2细胞和转基因小鼠肝组织的实验结果表明，在apoAⅠ-apoCⅢ-apoAⅣ区存在大范围染色质开放结构：在这个区域，高水平的组蛋白H3乙酰化修饰和H3K4甲基化修饰不仅分布在启动子区，而且出现在基因间区：与基因转录水平相应，大范围组蛋白乙酰化修饰水平在HepG2细胞，于apoAⅠ-apoCⅢ区略高；在Caco-2细胞，则于apoAⅣ-apoCⅢ区略高。对于apoAⅤ基因，在HepG2细胞仅启动子区有高水平组蛋白修饰，apoAⅤ-apoAⅣ基因间区则呈现低水平的组蛋白乙酰化修饰，表明apoAⅤ的染色质独立于大范围开放的apoAⅠ-apoCⅢ-apoAⅣ染色质结构之外。在apoAⅤ不表达的Caco-2细胞，apoAⅤ启动子区以及apoAⅤ-apoAⅣ间区的H3K4的甲基化修饰水平依然较高，而该处的乙酰化修饰水平很低。转基因动物实验结果表明，在增强子删除株系，apoAⅠ-apoCⅢ-apoAⅣ区域的大范围组蛋白乙酰化修饰水平显著下降，而各个株系apoAⅤ启动子区的组蛋白修饰水平变化不明显。 鉴于基因间转录与染色质开放以及增强子-启动子相互作用的潜在相关性，我们用RT-PCR方法检测了ApoAⅠ基因簇上的基因间转录状况，并在转基因小鼠的不同株系间进行基因间转录水平比较。同时，我们用生物信息学方法对在基因间区可能存在的调控元件进行预测，并对apoCⅢ增强子在染色质水平上的可能调控机制进行讨论。结果表明，基因间转录产物在apoAⅠ基因簇上广泛分布，甚至在低组蛋白修饰位点也可检测到。apoAⅠ基因簇内的基因间转录产物具有肝、肠组织特异性，而apoAⅤ及其下游ZNF259基因之间的转录产物不具有组织特异性。增强子删除株系的apoAⅠ-apoCⅢ和apoAⅣ-apoCⅢ基因间转录水平下降，并呈现出在肝组织以apoAⅠ-apoCⅢ间区、在肠组织以apoAⅣ-apoCⅢ间区的转录水平下降更为显著的倾向性。用生物信息学方法，发现在apoAⅣ下游存在的AT回文结构区具有核基质结合序列(nuclearmatrixattachmentregion，MAR)的特征。有报道该序列因易于形成十字结构而成为基因转位的发生位点。用ChIP方法发现，这个潜在的MAR与apoAⅣ基因之间区域的组蛋白修饰水平很低。 综上结果说明：1)apoCⅢ增强子与apoAⅤ启动子具有相互作用的潜能。2)在apoAⅠ/CⅢ/AⅣ/AⅤ基因簇，组蛋白乙酰化修饰状况与基因转录活性相关，而组蛋白H3K4甲基化可能代表具有转录潜力的染色质结构。3)apoAⅠ-apoCⅢ-apoAⅣ的大范围组蛋白乙酰化修饰水平与这三个基因的转录水平一致，apoAⅤ则位于apoAⅠ-apoCⅢ-apoAⅣ区的大范围组蛋白乙酰化修饰结构域之外。4)广泛存在的组织特异性基因间转录可能参与了apoAⅠ基因簇的转录调控。5)apoCⅢ增强子不仅影响apoAⅠ-apoCⅢ-apoAⅣ区域的大范围组蛋白修饰，还对apoAⅠ-apoCⅢ-apoAⅣ基因间区的转录起调控作用。6)生物信息学分析表明，apoAⅣ下游存在潜在的MARs序列，它可能隔离了增强子对apoAⅠ-apoCⅢ-apoAⅣ区的大范围染色质开放结构域向apoAⅤ方向的扩展。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文名词及缩写

前 言

一、真核基因表达调控的遗传和表观遗传机制

二、染色质水平的调控是基因转录调控的重要部分

1.组蛋白修饰是基因表达在染色质水平调控的重要方式之一

2.DNA水平的转录调控与染色质结构密切相关

3.基因间转录参与转录调控并与染色质结构密切相关

三、ApoAI/CIII/AIV/AV基因簇的表达调控

1.ApoAI/CIII/AIV/AV基因簇的结构

2.ApoAI/CIII/AIV/AV基因簇与脂类代谢以及心血管疾病

3.ApoAI/CIII/AIV/AV基因簇的表达调控

四、染色质免疫沉淀(ChIP)方法的原理及应用

五、本研究的主要内容

材料和方法

一、实验材料

1.菌株和质粒

2.细胞系

3.实验动物

4.限制性内切酶及修饰酶

5.抗体

6.其它主要试剂

7.试剂盒

8.引物合成

9.主要仪器设备

二、实验方法

1.研究的基本技术路线

2.细胞的培养

3.Apo CIII增强子和apoAV启动子体外相互作用可能性的确定

4.半定量RT-PCR方法测定Caco-2和HepG2细胞系apoAI基因簇基因转录水平

5.ChIP方法检测人apoAI基因簇在HepG2和Caco-2细胞系的组蛋白修饰状况

6.人apo AI/CIII/AIV/AV基因簇转基因小鼠正常株系和增强子突变株系肝组织组蛋白修饰比较

7.人apo AI/CIII/AIV/AV基因簇基因间转录产物的鉴定

实验结果

1.Apo CIII增强子-apoAV启动子的报告基因瞬时转染实验

1.1含apo AV启动子和apo CIII启动子的载体构建

1.2含apo CIII增强子-apo AV启动子和apo CIII增强子-apoCIII启动子的载体构建

1.3报告基因荧光素酶测定

2.Apo AI/CIII/AIV/AV基因簇在HepG2和Caco-2细胞系的转录水平比较

3.Apo AI/CIII/AIV/AV基因簇在HepG2和Caco-2细胞系的组蛋白修饰分析

3.1Apo AI基因簇细胞特异性组蛋白H3乙酰化修饰

3.2Apo AI基因簇组织特异性组蛋白H3K4甲基化修饰

4.人Apo AI/CIII/AIV/AV基因簇转基因小鼠正常株与增强子删除株的组蛋修饰比较

4.1ApoAI基因簇组蛋白H3乙酰化水平比较

4.2ApoAI基因簇组蛋白H3K4甲基化水平比较

5.Apo AI/CIII/AIV/AV基因簇基因间转录分析

5.1HepG2和Caco-2细胞系中ApoAI基因簇基因间转录产物分析

5.2人ApoAI基因簇转基因小鼠的肝、肠组织基因间转录产物分析

5.3人ApoAI基因簇转基因小鼠增强子突变株的apoAI-apoCIII间区及apoAIV-apoCIII间区的转录水平下降

6.Apo AI/CIII/AIV/AV基因簇隔离子元件预测

6.1生物信息学分析存在核基质结合序列(MAR)

6.2潜在的MAR与apoAIV之间存在局部的低组蛋白H3乙酰化和低H3K4甲基化修饰

讨 论

1.Apo CIII增强子与apo AV启动子具有相互作用的潜能

2.Apo CIII增强子影响apoAI/CIII/AIV/AV基因簇的组蛋白修饰以调控基因转录

2.1ApoAI-apoCIII-apoAIV区的大范围组蛋白H3乙酰化修饰参与apo基因转录调控

2.2ApoAI-apoCIII-apoAIV区的组蛋白H3K4甲基化修饰结构域终止在apoAIV基因下游

2.3ApoAV启动子区独立于大范围开放的apo AI-apoCIII-apoAIV区染色质结构之外

2.4Apo CIII增强子参与建立apo AI-apoCIII-apoAIV区染色质结构的大范围开放

3.ApoCIII增强子调控apo AI-apoCIII及apo AIV-apoCIII基因间区转录

3.1Apo AI基因簇上广泛存在组织特异性基因间转录产物

3.2增强子调控apo AI-apoCIII及apo AIV-apoCIII基因间区转录

4.染色质隔离元件对apo AI/CIII/AIV/AV基因簇调控的可能性

5.本研究的不足之处及今后实验的设想

5.1关于Apo AI基因簇转基因小鼠模型作为染色质研究的可行性

5.2关于染色质结构分析

5.3展望

小 结

参考文献

文献综述 Opening the chromatin for transcription

致谢

个人简历