骨髓干细胞诱导分化的肝细胞移植对大鼠肝切除术后肝衰治疗作用的实验研究

摘要

研究背景和目的：原位肝移植(OLT)是目前治疗急性肝功能衰竭、终末期肝病和代谢性肝病最有效的方法，但由于供肝缺乏等原因在临床广泛开展仍有一定的困难。肝细胞移植(HCT)与原位肝移植比较，具有价廉、操作简单、可重复进行、移植细胞可以体外培养增殖及冷冻保存，还可以进行基因修饰等优点。研究发现HCT可以纠正先天性肝脏代谢缺陷、辅助肝功能支持和替代受损肝实质。随着HCT在理论与技术方面不断发展，已逐渐呈现出替代OLT治疗肝病的潜力，当前肝细胞来源短缺、肝细胞移植后增殖能力差及免疫排斥等问题是限制HCT发展的主要原因。 骨髓干细胞(BMSC)可以横向分化为肝前体细胞和肝细胞，并具有取材容易；增殖能力强；体外培养、传代及扩增容易；可以直接取材于患者本人，能避免移植后免疫排斥反应的发生等特点。用BMSC替代成熟肝细胞进行移植治疗肝病，有望使细胞移植在肝病治疗方面取得重大突破。 BMSC可以通过两种方式对肝脏进行修复，一是直接进行BMSC移植，然后BMSC在体内分化为肝细胞并增殖，从而使肝脏得以修复；二是体外诱导BMSC定向分化为肝细胞或肝前体细胞并传代扩增后再进行移植。目前的研究大都直接进行BMSC移植，关于移植骨髓干细胞体外诱导分化的肝细胞治疗急性肝衰的研究国内外尚无相关报道。 本实验主要研究目的：探讨骨髓干细胞诱导分化的肝细胞移植对肝切除术后肝衰大鼠的治疗作用。 研究方法： 1、复苏大鼠骨髓干细胞诱导分化的肝细胞及检测其功能3复苏冷冻保存的由大鼠骨髓干细胞诱导分化的肝细胞，应用苔盼蓝染色测定复苏后细胞活率，将复苏后肝细胞培养24小时后测定培养液中ALB浓度，于移植前用BrdU标记肝细胞，用PBS液调细胞浓度为106/ml备用。 2、大鼠急性肝衰模型的建立 (1)、SD大鼠随机分为三组，A组(切除85％肝组织)、B组(切除90％肝组织)、C组(切除95％肝组织)，观察术后各组大鼠的一般情况、存活率、血清生化指标及肝组织病理变化，建立在我院实验条件下的大鼠急性边缘性肝衰模型。 (2)、SD大鼠随机分为两组，A组腹腔注射倒千里光碱(用量为30mg/kg)，B组腹腔注射生理盐水，注射两次后切除大鼠肝组织70％，观察术后各组大鼠的一般情况、存活率、血清生化指标，建立抑制了内源性肝细胞增生的大鼠急性肝衰模型。 3、骨髓干细胞诱导分化的肝细胞移植对大鼠急性肝衰的治疗作用 (1)、采用切除大鼠90％肝组织建立的急性肝衰模型，分三组进行治疗实验，A组于脾包膜下移植入骨髓干细胞在体外诱导分化的肝细胞2～4×106个、B组于脾包膜下移植入骨髓干细胞2～4×106个、C组于脾包膜下移植入PBS液，观察术后大鼠的存活率、血清生化指标及受体大鼠肝组织内移植细胞情况。 (2)、采用抑制了内源性肝细胞增生的大鼠急性肝衰模型，分两组进行治疗实验，A组于脾包膜下移植入骨髓干细胞在体外诱导分化的肝细胞2～4×106个、B组于脾包膜下移植入PBS液，观察术后大鼠的存活率、血清生化指标及受体大鼠肝组织内移植细胞情况。 研究结论： 1、复苏冷冻保存的大鼠骨髓干细胞在体外经诱导分化的肝细胞具有较高的活率，并保持有肝细胞的特征，可用于细胞移植。 2、90％肝切除诱导的肝衰是一个理想的大鼠急性边缘性肝衰模型，术后3天内为观察肝衰情况的窗口期。应用腹腔注射倒千里光碱+70％肝切除可建立抑制了内源性肝细胞增生的大鼠急性肝衰模型。 3、大鼠骨髓干细胞在体外经诱导分化的肝细胞脾内移植可明显改善急性边缘性肝衰大鼠的存活率，部分改善肝功能，移植肝细胞可在受体肝组织中存活并发挥肝细胞功能。 4、大鼠骨髓干细胞在体外经诱导分化的肝细胞脾内移植可改善抑制了内源性肝细胞增生的肝衰大鼠的部分肝功能，移植细胞可在受体肝组织中存活并发挥肝细胞功能，外源性移植细胞在肝衰的治疗中起主要作用。

目录

缩略词表

前言

第一部分：复苏冻存的大鼠骨髓干细胞诱导分化的肝细胞及检测其功能

第二部分：大鼠急性肝衰模型的建立

第三部分 骨髓干细胞诱导分化的肝细胞移植对大鼠急性肝衰的治疗作用

总结

参考文献

综述 骨髓干细胞与肝细胞移植的研究进展

攻读博士期间研究成果

致谢