发现一个新的IKKβ结合蛋白——新基因Hs.188881

摘要

在人类基因组计划完成后，面对众多的基因序列数据，如何对这些数据迅速进行分析，揭示未知基因序列的功能，如何针对国内外未见报道的、功能不清楚的“新”基因，进行药物靶点基因、疾病相关基因的筛选研究，以期发现原创的、有自主知识产权的、有临床应用价值的新基因是一个激动人心而又紧迫的课题。目前研究基因功能的主要手段有很多，它们有各自的优点和局限。本文采用基于与人类疾病相关的已知功能和全长基因构成的酵母双杂交文库，克服了以往使用组织文库的缺点。利用这一筛选平台可以大大加快我们对未知功能基因的筛选速度。另外，我们又利用流式细胞技术、报告基因技术和基因转染对筛选到的基因进行初步的功能研究。 一、通过酵母双杂交技术发现相互作用蛋白基因在实验室的前期工作中，我们从476个基因序列中排除预测有跨膜结构域和信号肽的基因和蛋白序列过短、文献较多的序列后。对剩下的序列，进一步进行Motif、Domain的分析和亚细胞定位预测等，最终选定了13个基因，将他们分别插入酵母载体。 在本实验中，我们利用酵母双杂交平台筛选与目标库中1500个基因有相互作用的基因，得到了2对相互作用的蛋白。其中，我们用11＃(Hs.188881)基因完整的开放阅读框构建的“诱饵”质粒，筛选人已知基因构成的pACT2cDNA文库，得到在酵母细胞中与11＃(Hs.188881)基因编码产物相互作用的蛋白：IKKβ(IkBKinaseβ)，并进行了假阳性排除实验，结果证明融合蛋白AD-IKKβ不具有自激活作用。结合前期的工作，我们初步认为11＃(Hs.188881)基因编码蛋白可能与IKKβ相互作用。随后，我们采用GST融合蛋白沉降技术(Pull-down)和细胞内免疫共沉淀方法(Coimmunoprecipitation)对蛋白质之间相互作用进行了验证，结果表明11＃(Hs.188881)基因编码产物在体内外均能与IKKβ相互结合。对11＃(Hs.188881)基因的细胞内定位结果显示，其编码的蛋白在细胞的胞浆有分布。 二、应用萤光素酶报告基因检测NF-κB等活性我们采用NF-κB萤光素酶报告基因检测技术观察两者的关系。实验结果表明，11＃(Hs.188881)基因编码蛋白确实能够轻度抑制NF-κB的活性，并且其两个截断体对NF-κB的抑制作用强度不同，羧基端11C抑制作用可以达到60％，氨基端11N基本没有抑制作用。根据其他实验结果我们推测11＃(Hs.188881)基因编码蛋白是IKKβ的磷酸化底物。 此外，根据实验的需要利用原核系统表达了11＃(Hs.188881)基因编码蛋白，并制备了兔抗11＃(Hs.188881)的多克隆抗体。 本研究对进一步了解靶基因11＃(Hs.188881)基因编码蛋白在关于炎症中TNF信号传递通路中的作用的相关功能提示具体的线索，对于设计以11＃(Hs.188881)基因编码蛋白为基础的具有重要应用价值的药物作用靶点或基因工程药物奠定了基础。

目录

缩略语对照表

前 言

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

小 结

参考文献

caspase-10研究进展

致 谢

个人简历

附 录