组蛋白去乙酰化酶抑制剂Apicidin诱导增强人γ-珠蛋白基因表达的分子机制研究

摘要

真核基因表达是一个复杂调控的过程，细胞应答外界环境信号的刺激实现基因时空特异性的表达是有机体生命活动的基础。珠蛋白基因簇是研究基因表达遗传调控与表观遗传调控的良好模型，共分为α-和β-两个簇。人α-珠蛋白基因簇位于第16号染色体，共包括3个结构基因(5’-ζ-α2-α1-3’)；人β-簇位于11号染色体，包括5个功能基因(5’-ε-<'G>γ-<'A>γ-δ-β-3’)。在红系发育过程中，两类珠蛋白基因簇协同表达，始终保持产物的平衡，分别产生胚胎型(ζ<,2>ε<,2>)、胎儿型(α<,2>γ<,2>)和成年型(α<,2><,2>)血红蛋白四聚体。 至今已发现有上千种遗传突变可影响两类珠蛋白基因的表达与正常血红蛋白四聚体的形成，最终导致地中海贫血病的发生。其中α-珠蛋白基因的突变或缺失引起的称之为α-地中海贫血病(α-地贫)；由β-珠蛋白基因的突变或缺失引起的称之为β-地中海贫血病(β-地贫)或镰刀型贫血症(SCD)。地中海贫血已是世界性健康问题，最新统计显示世界人口中4.83％携带有珠蛋白基因的突变，其中包括1.67％的人口是杂合的α-地贫和β-地贫。 β-地贫的病理生理学分析表明，药物诱导胎儿型血红蛋白基因的表达是缓解和治疗这类疾病的重要举措。因为α-珠蛋白亚基的过量与β-珠蛋白表达的不足所引起的两类终产物的不平衡是β-地贫的主要发病原因，γ-珠蛋白的增强表达形成α<,2>γ<,2>血红蛋白四聚体弥补了这种不平衡，进而缓解了病情。而脱氧产生的镰刀型血红蛋白多聚体所引起的血管阻塞是SCD发病的主要因素，γ-珠蛋白的增强表达可以干扰镰刀型血红蛋白分子的聚化。 另外，通过对β-珠蛋白基因簇的表达调控机制研究发现，在成年型β-珠蛋白基因表达时，其启动子区DNA甲基化水平较低，活性组蛋白修饰水平较高；而在胎儿型γ-珠蛋白基因的启动子却是高度的DNA甲基化与较低的活性组蛋白修饰状况。胎儿期表达γ-珠蛋白基因时，这种情况正好相反。以上研究结果提示基于表观遗传调控的原理，通过改变染色质开放状态激活并增强γ-珠蛋白基因的表达将是一个非常可行的策略。 目前，DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮胞苷(5-Aza)，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)丁酸盐类、制滴菌素(TSA)等己在临床和实验中使用。但由于很大的副作用，以及有限的激活与增强γ表达的效力，极大地限制了这些药物的临床适应症。因此，寻找新的γ-珠蛋白的诱导剂将是治疗β-地-贫-的一条新的出路。 最近发现的一种HDACiApicidin在K562细胞中可以诱导γ-珠蛋白基因表达水平增高达10倍以上。通过我们的实验显示，Apicidin诱导增强γ-珠蛋白表达的有效浓度对细胞增殖的抑制作用较弱。另外，与以前报道的丁酸盐类、TSA、羟基脲(HU)类似，Apicidin在激活与增强γ-基因表达时，伴随着P38 MAPK信号通路的激活，并且当P38 MAPK通路被特异性阻断时，这类药物的γ-珠蛋白诱导能力几近消失。因而，进一步阐述这种高效的γ-珠蛋白诱导剂Apicidin的作用机制，以及如何与P38MAPK信号通路协同作用增强γ-珠蛋白基因的表达，对于这一药物最终应用于临床都会有一定的理论指导意义。 本实验中，我们首先运用MTT、细胞流式分选(FACS)等技术检测了Apicidin对K562细胞增殖、细胞周期与凋亡的影响。联苯胺染色结合RT-PCR分析了其对于K562细胞分化以及增强γ-珠蛋白表达的影响。为了进一步阐述该药诱导γ-珠蛋白基因表达的分子机制，我们又在转录与翻译水平分别检测了Apicidin对参与调控γ基因表达的红系特异性转录因子GATA-1、GATA-2、NF-E2/P45和P18表达的影响。进一步的CHIP实验检测了整个β-簇LCR区、ε与γ基因启动子区及基因间区的H3乙酰化与H3K4双甲基化的修饰变化；同时将P38 MAPK通路阻断后对上述结果产生的影响也逐一作了分析。最后，在细胞水平上运用DNA荧光原位杂交(FISH)技术分析了Apicidin对β-簇核定位的影响。 结果表明：(1)Apicidin对细胞的增殖与生长只有很弱的抑制作用。(2)Apicidin诱导K562细胞向红系方向分化并伴随着γ-珠蛋白基因mRNA表达水平升高7-10倍，P38 MAPK通路的阻断抑制了Apicidin的诱导作用；同时，Apicidin的作用具有细胞特异性，在Hela细胞不能诱导γ-珠蛋白基因的表达。(3)Apicidin的作用增加了K562细胞总的H3、H4乙酰化与H3K4双甲基化修饰的水平，并且不受P38 MAPK通路的影响。(4)进一步的ChIP分析显示，在Apicidin处理K562细胞6-12小时后，β-簇LCR上各个高敏位点(HS)，ε与γ基因间区的H3乙酰化与H3K4双甲基化修饰水平就有显著增加；然而当阻断P38 MAPK通路时，Apicidin促使的染色质活性组蛋白修饰水平增加的作用消失。在非红系Hela细胞中没有检测到类似的结果。(5)红系特异性的转录因子GATA-1 mRNA与蛋白水平在Apicidin处理24小时后都有明显升高，基本不受P38 MAPK通路的调节。ChIlP结果显示，Apicidin作用12小时后，GATA-1结合γ启动子区的能力明显加强；然而，当阻断了P38 MAPK通路时，GATA-1的结合又恢复到对照的水平。(6)Apicidin促进了RNA聚合酶Ⅱ(polⅡ)与普遍性转录因子SP1向LCR、ε与γ启动子区的募集，且不受P38 MAPK信号通路的调节。(7)DNA FISH结果表明，Apicidin可促使β-簇从染色体领地(chromosome territory)的环出。 以上结果表明：(1) Apicidin以及与Apicidin类似的γ珠蛋白基因的诱导剂可能大范围影响了β-簇的染色质结构，因而，传统的γ启动子活性分析法的药物筛选方式可能需要改进，要考虑所筛选药物对β-簇整体的影响。(2)LCR、ε与γ基因区的活性组蛋白修饰水平的显著提高，结合LCR成环调控作用的最新研究进展，我们推测Apicidin作用下基因间组蛋白乙酰化促使的染色质环调控功能的加强是诱导γ珠蛋白基因增强表达的主要分子机制，并且P38 MAPK通路通过调节组蛋白乙酰化修饰水平参与这一过程。(3)转录因子GATA-1、NF-E2/P45、SP1，以及pol Ⅱ在Apicidin处理前后与β-簇上近远端调控元件的动态结合，可能协同促使γ珠蛋白基因的增强表达；同时，P38 MAPK信号通路协同调节这一过程。(4)Apicidin作用下引起的大范围组蛋白乙酰化修饰水平的提高与染色质的重塑可能是其影响β-簇核定位的原因。(5)综合以上研究的结果可以看出，对Apicidin诱导γ珠蛋白基因增强表达作用机制的探讨有助于药物筛选策略的优化，同时对该类药物走向临床具有潜在的理论指导意义。由于Apicidin本身就是一种有效的诱导剂，同时具备临床使用药物的一些特性，因此有可能进入临床用于β-地贫与SCD病人的治疗。

目录

论文说明：英文名词及缩写

声明

摘要

前言

1.人β-珠蛋白基因簇与真核基因表达调控研究

1.1人β-珠蛋白基因簇的结构特点

1.2人β-珠蛋白基因簇是研究真核基因表达调控的经典模型

1.3表观遗传调控与人类遗传疾病的关系

2.人β-珠蛋白基因簇相关的分子遗传病

2.1 β-地中海贫血和镰刀型贫血病及其发病机制

2.2人γ-珠蛋白基因的激活表达是治疗这类疾病的重要策略

2.3通过药物激活人γ-珠蛋白基因的表达是一条有效的途径

2.4基于表观遗传调控原理的人γ-珠蛋白基因的诱导表达与激活

2.5 P38MAPK信号通路及其在HDACi激活人γ-珠蛋白基因表达中的作用

3.本研究的理论问题与主要内容

材料与方法

1.实验材料

1.1菌株与质粒

1.2细胞系

1.3限制性内切酶及修饰酶

1.4实验用抗体

1.5其它主要试剂和材料

1.6主要仪器设备

2.实验方法

2.1基本技术路线

2.2细菌操作与质粒的转化

2.3细胞培养

2.4 Apicidin对K562和Hela细胞的不同浓度和时间的处理

2.5 Apicidin影响K562细胞增殖的MTT分析

2.6流式细胞仪检测Apicidin对K562细胞周期的影响

2.7半定量RT-PCR对人β类珠蛋白基因和红系转录因子等的表达分析

2.8 Western-Blotting分析组蛋白修饰模式和转录因子蛋白水平的变化

2.9人β类珠蛋白基因簇染色质结构和转录调控因子募集的染色质免疫沉淀（ChIP）分析

2.10限制性内切酶柔顺性实验（Restriction enzyme accessibility assay）

2.11荧光原位杂交(FISH)技术检测经Apicidin处理的β珠蛋白基因簇核定位模式

实验结果

1.Apicidin对K562细胞增殖与分化影响的分析

1.1 Apicidin对K562细胞的增殖活性具有微弱抑制作用

1.2 Apicidin可诱导K562细胞周期阻滞和凋亡

1.3 Apicidin能够诱导K562细胞向红系方向分化

1.4 Apicidin使人γ-珠蛋白基因的表达明显升高

1.5 Apicidin使GATA-1表达上调而GATA-2表达下降

2.Apicidin明显增加K562细胞总H3、H4乙酰化和H3 K4双甲基化修饰水平

3.ChIP检测Apicidin对β珠蛋白基因簇染色质组蛋白修饰状态的影响

3.1 ChIP分析条件的建立

3.2 Apicidin使人β珠蛋白基因簇LCR区活性组蛋白修饰水平明显升高

3.3 Apicidin使人γ和ε启动子、5'区及基因间区活性组蛋白修饰发生动态变化

4.Apicidin可激活P38 MAPK信号通路而瞬时抑制ERK通路

5.P38 MAPK通路的阻断抑制了Apicidin的诱导作用

6.P38 MAPK通路的阻断使Apicidin处理下β珠蛋白基因簇组蛋白修饰水平下降

7.P38 MAPK通路的阻断抑制了Apicidin促使的GATA-1表达上调

8.人β珠蛋白基因启动子和LCR区RNA Pol Ⅱ和转录因子的结合分析

8.1 Apicidin使β珠蛋白基因簇募集Pol Ⅱ的水平明显升高，且不受P38 MAPK通路的调节

8.2 Apicidin处理和P38 MAPK信号通路阻断前后转录因子的结合分析

9.Apicidin可明显促使人β-簇从CT区的环出

讨论

1.Apicidin可诱导增强γ-珠蛋白基因的表达并具备潜在的临床应用前景

2.Apicidin与P38 MAPK通路协同作用提高β-簇染色质活性状态以激活人γ-珠蛋白基因的表达

2.1 LCR、ε与γ基因间区组蛋白乙酰化水平的显著增加加强了染色质成环作用

2.2基因间转录与pol Ⅱ的募集是Apicidin增强γ-珠蛋白基因表达的潜在分子机制

2.3 P38 MAPK信号通路的阻断可能破坏了组蛋白共价修饰间的协调作用

2.4组蛋白乙酰化转移酶可能介导了P38 MAPK通路参与增强γ-珠蛋白基因的表达

3.GATA-1、SP1、NF-E2/P45可能参与Apicidin、P38 MAPK通路协同增强人γ-珠蛋白基因的表达

3.1 GATA-1

3.2 NF-E2

3.3 SP1

4.Apicidin影响β-珠蛋白基因簇核定位及其潜在的分子基础

5.本研究不足之处和今后的工作设想

小结

参考文献

文献综述 REVIEW ARTICLE Charting gene regulatory networks:strategies,challenes and perspecives

致谢

个人简历