SIRT1在血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成中的作用及分子机制研究

摘要

新生内膜形成与血管重塑密切相关，主要包括血管平滑肌细胞的增殖、迁移、凋亡以及基质成分合成、降解及重新排列等过程。过度的血管平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化、肺动脉高压、系统性高血压、腹主动脉瘤及经皮腔内血管成形术后再狭窄等心血管疾病的重要病理基础。细胞增殖主要通过以下三种蛋白进行调控：周期蛋白依赖性蛋白激酶(Cyclin-dependentkinase，CDK)，周期蛋白(Cyclin)，周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子(Cyclin-dependentkinaseinhibitor，CKI)。其中CyclinD1在细胞周期中最早被合成，于G1中期到达高峰，并与CDK4/CDK6形成复合物，对决定G1/S期转换的限制点进行调控。CyclinD1主要有转录水平及泛素化降解途径的调控，在生长因子刺激下，多种转录因子如：AP-1(activatorprotein-l)，NF-κB(nuclearfactor-κB)，SP1等激活CyclinD1，在转录水平调控CyclinD1的表达，其中AP-1对其的调控研究最多。
　　 人类SIRT1(SIRTuin1)是NAD+依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，在各物种之间呈现高度的保守性，在7个SIRT成员中与酵母Sir2(silenceinformationregulator2)的同源性最高。近年来的研究发现，SIRT1能够去乙酰化组蛋白(H3，H4)和多种转录因子和转录辅助因子，包括MyoD、p300、PGC-1α、PPARγ、NF-κB、Ku70、p53、FOXO、E2F1等，在胚胎发育、组织分化、代谢调节、细胞凋亡、DNA损伤修复和抵抗应激方面发挥重要的作用。在多种细胞中的研究发现，SIRT1还能够直接调节细胞周期和细胞增殖。因此我们设想：在平滑肌细胞中过表达SIRT1能够抑制细胞增殖，从而对抗血管增殖性疾病的增殖。
　　 本研究首先应用RT-PCR和Westernblot检测了SIRT1在血清处理的血管平滑肌细胞和结扎后的颈总动脉中的表达变化。随后我们应用RT-PCR、Southernblot、Westernblot、免疫组化等方法对平滑肌特异性SIRT1转基因鼠进行鉴定，应用小鼠颈总动脉结扎模型，采用HE染色、免疫组化、Masson染色、TUNEL染色等方法观察转基因鼠新生内膜形成，血管平滑肌细胞增殖，细胞外基质(ECM)及动脉中细胞凋亡。进一步通过H3-TdR、流式细胞术检测SIRT1在体外对细胞增殖和细胞周期的影响。随后，通过Westernblot、RT-PCR观察在基础水平和血清诱导下，过表达和干扰SIRT1对细胞周期蛋白表达水平的影响；用荧光素酶报告系统检测对AP-1下游基因CyclinD1活性的影响；ChIP检测SIRT1以及AP-1两个亚基c-Fos/c-Jun在CyclinD1启动子上的募集。
　　 本研究发现血清处理的血管平滑肌细胞中SIRT1表达先升高，最后表达显著降低，小鼠颈总动脉结扎模型中SIRT1表达随新生内膜形成短暂的升高后，显著降低。实验表明SIRT1转基因鼠可以抑制由颈总动脉结扎所引起的新生内膜形成，并且可以减少细胞外基质，但血管平滑肌细胞凋亡没有显著变化。腺病毒介导的SIRT1过表达可以抑制基础水平和血清诱导的原代血管平滑肌细胞增殖，并使其血清诱导的原代血管平滑肌细胞阻滞在G1期。SIRT1在体内外抑制G1期开关分子CyclinD1的表达，进一步研究表明SIRT1在血管平滑肌细胞中结合c-Fos/c-Jun并抑制其在CyclinD1启动子上的募集，这可能是导致SIRT1抑制CyclinD1表达变化的分子基础。
　　 我们的研究发现小鼠颈总动脉结扎模型中SIRT1表达随新生内膜形成降低；SIRT1在体内也可以降低CyclinD1的表达，并可能由此抑制新生内膜形成。在血管平滑肌细胞中，SIRT1通过抑制c-Fos/c-Jun在CyclinD1启动子上的募集，从而降低CyclinD1的表达，使血管平滑肌细胞阻滞在G1期，并进而抑制血管平滑肌细胞的增殖。因此，SIRT1是调控平滑肌细胞增殖的重要基因，提高SIRT1的表达可以作为抑制血管平滑肌细胞增殖和新生内膜形成，影响血管重塑过程的一个新手段。

目录

前言

1.以血管平滑肌细胞增殖为基础的心脑血管疾病对人类健康危害严重

2.血管平滑肌细胞增殖与心血管疾病

2.1血管平滑肌细胞增殖是构成以新生内膜形成为基础的血管重塑的重要细胞学基础

2.2血管平滑肌细胞的增殖与动脉粥样硬化等血管增殖性疾病的发生、发展密切相关

3.血管平滑肌细胞周期及其调控

3.1血管平滑肌细胞的增殖周期

3.2细胞周期调控

4.SIRT1的功能提示它可能有抵抗血管平滑肌细胞增殖及缓解血管增殖性疾病的作用

5. SIRT1是否能够抑制血管平滑肌细胞增殖是本研究的重点

实验材料

1.菌株与质粒

2.实验用小鼠及饲料

3.限制内切酶和其他修饰酶

4.细胞系

5.其他主要试剂

6.放射性核素

7.实验用抗体

8.主要仪器设备

实验方法

1.细菌操作与质粒的转化

1.1 感受态大肠杆菌DH5α制备

1.2 质粒的转化和扩增

1.3 质粒的提取和纯化

2.转基因鼠的鉴定及传代

2.1 利用PCR鉴定转基因鼠

2.2 利用Southern杂交鉴定转基因鼠

2.3转基因鼠的传代

3.小鼠颈总动脉结扎损伤模型

4.小鼠组织器官的采集和保存

5.组织切片、HE染色和免疫组化

5.1 组织切片

5.2 HE染色及形态学分析

5.3 免疫组化

6.细胞培养

6.1 细胞的生长条件

6.2 细胞的传代

6.3 细胞的复苏及冻存

7.正常大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的培养

7.1 血管平滑肌细胞原代培养

7.2 血管平滑肌细胞传代培养

7.3 血管平滑肌细胞的冻存与复苏

7.4 血管平滑肌细胞的腺病毒感染

7.5 10%FBS处理血管平滑肌细胞

8.重组腺病毒的制备

8.1 建立备用病毒

8.2 重组腺病毒的生产

8.3 病毒纯化

8.4 重组腺病毒质量检测

9.半定量RT-PCR

9.1 RNA提取

9.2 逆转录PCR(RT-PCR)

10.Western Blot

10.1 细胞及组织总蛋白提取

10.2 蛋白质浓度测定

10.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)

10.4 抗原抗体反应

10.5 辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白(ECL反应)

10.6 溶液配制

11.3H-TdR

12.流式细胞仪检测细胞周期

13.启动子报告基因的构建及活性检测

13.1 CyclinD1启动子报告基因,缺失及点突变克隆构建

13.2 双荧光素酶报告系统测定启动子活性

14.蛋白质免疫共沉淀

14.1 细胞裂解

14.2 免疫沉淀

14.3 SDS-PAGE

15.染色质免疫共沉淀(ChIP)

15.1 细胞固定

15.2 细胞核的提取

15.3 细胞核的裂解与超声处理

15.4 超声结果的分析

15.5 免疫沉淀

15.6 DNA的分离及纯化

15.7 半定量PCR反应

15.8 Real-time PCR检测

15.9 溶液配制

16.统计学方法

实验结果

1.平滑肌细胞内源性SIRT1表达

1.1 SIRT1在血管平滑肌细胞,平滑肌细胞系和小鼠动脉中表达

1.2 10%FBS处理的血管平滑肌细胞SIRT1表达先升高后降低

1.3 小鼠颈总动脉结扎模型中SIRT1表达随新生内膜形成显著降低

2.平滑肌特异的SIRT1转基因鼠中,颈总动脉结扎引起的新生内膜形成受到显著抑制

2.1 平滑肌特异的SIRT1转基因鼠的鉴定

2.2 转基因鼠中,颈总动脉结扎引起的新生内膜形成受到抑制

3.SIRT1抑制血管平滑肌细胞的增殖

4.SIRTl抑制血管平滑肌细胞和结扎28天颈总动脉中Gl期细胞周期蛋白CyclinD1的表达

4.1 SIRT1过表达下调了血管平滑肌细胞中CyclinD1,CyclinE,CDK2的表达

4.2 SIRT1过表达下调了A10细胞系中CyclinD1,CyclinE,CDK2的表达

4.3 SIRT1 RNAi干扰上调了血管平滑肌细胞中CyclinD1的表达

4.4 颈总动脉结扎的转基因鼠中,CyclinD1表达显著下降

4.5 SIRT1过表达下调了血管平滑肌细胞中CyclinD1的mRNA水平

5.AP-1介导了SIRT1对CyclinD1表达的抑制作用

5.1 SIRT1过表达抑制CyclinD1报告基因活性

5.2 AP-1介导了SIRT1对CyclinD1报告基因活性的抑制

5,3 SIRT1,c-Fos,c-Jun结合在CyclinD1启动子区

5.4 SIRT1 RNAi干扰增加了c-Fos,c-Jun和Ace-H3在CyclinD1启动子区的招募

讨论

1.选择血管平滑肌细胞作为研究对象的优势

2.SIRT1在新生内膜形成过程中具有内在保护作用的可能性

3.SIRT1抑制新生内膜形成

3.1 SIRT1抑制血管平滑肌细胞的增殖

3.2 SIRT1抑制血管平滑肌细胞的迁移

4 SIRT1抑制血管平滑肌细胞增殖的机制总结

5 本工作的不足和展望

小结

参考文献

综述

英文名词及缩写

致谢

个人简历

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