U2依赖型mRNA剪接复合体相关基因多态与原发性肝癌发生风险的关联研究

摘要

背景:原发性肝癌（Primary liver cancer，PLC，以下简称肝癌）病死率高，目前居于全球癌症死因第三位，肝癌在我国发病人数占全球发病人数的半数以上。肝癌发病隐匿，一旦发现往往预后很差。因此，探讨其危险因素并进行有针对性的预防是减少肝癌人群健康危害的关键。在癌症发生的遗传和环境因素研究中，目前mRNA剪接复合体相关基因突变与肿瘤的关系备受关注。mRNA选择性剪接影响着人类90％以上的基因表达，这个途径一旦发生异常，则可能影响包括细胞增殖、发育与分化等环节的多个基因的正常剪接过程，导致肿瘤发生。2011年以来，Nature、Cell等杂志先后报道剪接复合体基因突变，尤其是U2核糖核蛋白体依赖型剪接复合体相关基因（包括U2AF35、U2AF65、SF1、SRSF1、SF3A1、SF3B1和PRPF40B等）突变与血液肿瘤如慢性髓细胞性白血病以及实体瘤如胰腺癌、乳腺癌以及黑色素瘤等发生有关，我们课题组的前期研究也发现U2AF65的基因多态与胰腺癌的发生有关，但上述基因与肝癌发生风险关联尚未见报道。
　　目的:
　　1、探讨U2依赖型mRNA剪接复合体的关键基因U2AF35、U2AF65、SRSF1、SRSF2、SF3B1、SF3A1、SF1和PRPF40B与肝癌发生风险的关系。
　　2、分析上述基因与已报告的肝癌主要环境危险因素的交互作用对肝癌发生风险的影响。
　　方法:采用以医院为基础的两阶段病例-对照研究方法:
　　1、筛查阶段:选择2009年5月至2012年6月武汉同济医院首次确诊的378例原发性肝癌病例和461例同期成人体检非肿瘤对照。采用Openarray中通量分型技术在筛查样本中对U2依赖型mRNA剪接复合体的关键基因U2AF35、U2AF65、SRSF1、SRSF2、SF3B1、SF3A1、SF1和PRPF40的17个潜在功能标签单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位点进行基因分型;基于不同遗传模型分析上述候选SNPs与肝癌的关联性，并探讨其与吸烟、饮酒以及HBV慢性感染的交互作用。
　　2、验证阶段:选择2007年9月至2009年9月北京佑安医院首次确诊的428例原发性肝癌病例和647例同期体检的非肿瘤对照，对筛查阶段得到的阳性位点采用TaqMan实时荧光定量基因分型技术进行基因分型;同时探讨基因与肝癌的关联，以及基因与环境交互作用的影响。
　　结果:
　　1、筛查样本中观察到SF3A1基因的四个TagSNPs位点rs2074733、rs5994293、rs7288947和rs9608886与肝癌发病风险存在显著关联:以携带rs2074733-CC基因型者为参照，携带rs2074733-T等位基因者的肝癌发病风险降低，OR值为0.36(95％CI:0.25-0.53);以携带rs5994293-TT基因型者为参照，携带rs5994293-G等位基因者的肝癌发病风险降低，OR值为0.42(95％CI:0.29-0.61);以携带rs7288947-CC基因型者为参照，携带rs7288947-T等位基因者的肝癌发病风险降低，OR值为0.54(95％CI:0.41-0.72)和以携带rs9608886-TT基因型者为参照，携带rs9608886-G等位基因者的肝癌发病风险降低，OR值为0.17（95％CI:0.10-0.31）。
　　2、将上述四个位点在验证样本中进行验证后发现，SF3A1基因的rs5994293位点与肝癌发病风险仍旧存在关联。以携带TT基因型者为参照，携带G等位基因者的肝癌发病风险降低34％（95％CI:0.44-0.99，P=0.042），但P值经FDR校正后无统计学差异。
　　3、对两个阶段样本均发现存在强连锁不平衡的SF3A1基因rs7288947-rs5994293进行单体型分析，两个阶段样本中CG单体型均与肝癌发生风险有关。合并样本中以携带CT单体型的个体为参照，携带CG单体型肝癌发病风险降低到0.67(95％CI:0.55-0.82; P=0.0001)。
　　4、环境变量单因素分析结果显示，在两阶段研究样本中HBsAg阳性为肝癌的危险因素，合并样本的OR值为50.70(95％CI:37.08-69.31，P=1.16E-133);吸烟在筛查阶段样本中是肝癌发病的危险因素(OR=1.65;95％ CI:1.06-2.56，P=0.027)，合并样本中吸烟者肝癌发病风险是非吸烟者的1.36倍（95％CI:0.99-1.87，P=0.057）。
　　5、环境-环境、基因-环境交互作用结果显示:在两阶段研究样本中，观察到HBsAg与吸烟、饮酒存在加法交互作用，合并样本中HBsAg阳性与吸烟、饮酒的加法交互协同指数SI分别为2.12(95％CI:1.59-2.65)、1.83(95％CI:1.26-2.40);在合并样本中，观察到HBsAg阴性者中合并吸烟饮酒和SF3A1-rs5994293 TT基因型之间存在加法交互作用，加法交互协同指数SI为2.27(95％CI:1.43-3.12)。但在HBsAg阳性者中并没有观察到上述加法交互作用。
　　结论:
　　携带SF3A1-rs5994293-TT基因型可能增加肝癌的发生风险;在非HBV感染者中携带该基因型者，同时合并吸烟饮酒可增加肝癌的发生风险，但仍需大样本研究及功能研究的验证。

目录

摘要

前言

一、肝癌流行病学

二、肝癌危险因素

材料与方法

一、主要实验仪器

二、主要实验试剂和耗材

三、研究设计及研究对象

四、基因组DNA的提取

五、候选SNP挑选

六、基因分型

七、统计分析

结果

一、研究对象人口学特征

二、筛查阶段剪接复合体关键基因多态与肝癌关联性分析

三、验证阶段验证剪接复合体关键基因多态与肝癌的关联性

四、合并阶段剪接复合体关键基因多态与肝癌的关联性

五、单体型与肝癌发病风险的关联分析

六、基因-环境、环境-环境交互作用分析

讨论

一、遗传因素

二、环境因素

三、交互作用

四、本研究的优势与不足

小结

结论

参考文献

附录一 论文缩写词汇中英文对照表

附录二 个人简历

致谢

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