基于MS2噬菌体病毒样颗粒的流感病毒系列核酸检测质控品的研究

摘要

流行性感冒是由流行性感冒病毒(Influenza Viruses)引起的急性呼吸道传染病，据统计全球每年有约25万到50万人死于流行性感冒，因此，流行性感冒病毒严重威胁着人类的公共卫生安全。开展流感监测能及时发现、评估流感疫情，是控制流感流行或大流行的重要手段。目前，全国范围内已经建立起以流感监测网络实验室和流感哨点医院为基础的流感监测网络。
　　本研究针对公共卫生安全威胁较大的8种流感病毒(A/H1N1-2009亚型、季节性A/H1N1亚型、A/H3N2亚型、A/H5N1亚型、A/H7N9亚型、A/H9N2亚型、B/Yamagata和B/Victoria谱系流感病毒），采用MS2噬菌体病毒样颗粒包装平台，将各亚型/谱系流感病毒核酸检测的靶基因（血凝素基因、神经氨酸酶基因、基质蛋白基因、核蛋白基因、非结构蛋白基因）分别包入MS2噬菌体衣壳蛋白内部，制备了37种的病毒样颗粒作为流感病毒核酸检测模拟样本。为探讨流感病毒核酸检测试剂与其它人患病毒间的交叉反应情况，同时制备包裹麻疹病毒、风疹病毒和丙肝病毒核酸检测序列的病毒样颗粒3种，作为流感病毒核酸检测质评样本盘中的阴性样本，以检测流感病毒核酸检测试剂是否存在交叉反应。使用数字PCR方法对使用原核表达系统表达的病毒样颗粒进行核酸绝对定量，而后按比例稀释制备流感病毒核酸检测质评样本盘，包括26种病毒样颗粒制备的不同浓度的流感病毒核酸阳性模拟样本，1个真实A/H3N2亚型流感咽拭子样本和3个流感病毒核酸阴性样本。
　　共有35个参加流感病毒核酸检测室间质量评价实验室回报了结果，各个实验室均使用实时荧光定量RT-PCR方法，但提取试剂和检测试剂不尽相同，阴性样本的假阳性率为0％(0/957)，阳性样本检测的假阴性率为0.87％(14/1614)，错误率为1.3％(21/1614)。本次室间质量评价的结果表明，所研制的8种流感病毒核酸检测质控品，稳定可靠，成功地应用于全国流感病毒核酸检测室间质量评价活动。质评结果表明，国内大多数流感病毒核酸检测实验室具备已开展项目的流感病毒核酸检测能力。

目录

声明

英文缩略词

摘要

前言

1．材料和方法

1．1．实验材料和试剂配制

1．2．方法

1．2．1．内含流感病毒基因序列的表达载体的构建

1．2．2．重组病毒样颗粒的表达和纯化

1．2．3．重组病毒样颗粒的鉴定及定量

1．2．4．流感病毒核酸检测质评样本盘的建立

1．2．5．流感病毒核酸检测室间质量评价

1．2．6．质评结果的统计分析

2．结果

2．1．病毒基因DNA片段的获取与载体的构建

2．2．重组病毒样颗粒的表达和纯化

2．3．重组病毒样颗粒的鉴定

2．3．1．琼脂糖凝胶电泳鉴定重组病毒样颗粒

2．3．2．SDS-PAGE鉴定重组病毒样颗粒

2．3．3．逆转录PCR鉴定重组病毒样颗粒内含目的RNA序列

2．3．4．数字PCR定量病毒颗粒核酸拷贝数

2．3．5．样本盘的建立及验证

2．3．6．漂流样本检测结果

2．3．7．2016年全国流感病毒核酸检测室间质量评价结果

3．讨论

参考文献

论文综述 逆转录PCR在流感病毒检测中的应用

附录

致谢

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