双黄连注射液致敏反应特征及致敏标志物研究

摘要

中药注射剂是我国传统医学和现代制药技术相结合的产物，具有价格低廉、疗效显著等优势。现今全国有400多家企业生产已有批准文号的109种中药注射剂，年销售额超过200亿元，年使用量超过4亿人次。
　　中药注射剂由于其成分和制造工艺等方面的复杂性，近年来随着临床上的广泛应用，出现了一系列以过敏反应为代表的不良反应。双黄连注射液（Shuanghuanglian Injection）由金银花、黄芩、连翘3味中药的提取物配制而成，具有清热解毒的功效和抗菌抗病毒的药理作用，临床上用于治疗上呼吸道感染等炎症的疗效较好，使用非常广泛。不容忽视的是随着使用量的增加，双黄连注射液的不良反应也逐渐显现出来。双黄连注射液自2002年上市后，先后2次由于严重不良反应的发生在2001年11月第1期和2009年5月第22期由国家药品不良反应监测中心发布的《药品不良反应信息通报》中被采取管制措施。双黄连注射液为中药注射剂大品种，在多篇研究报道中都可以看到其居于中药注射剂不良反应首位，以双黄连注射液为例进行研究具有代表性及现实意义。本研究以双黄连注射液为研究对象，对其体内、体外致敏特征和体内致敏标志物分别进行了系统性的研究:
　　本文主要从以下几方面进行论述：
　　第一部分 双黄连注射液致敏特征体内研究
　　目的：明确双黄连注射液过敏类型，研究其体内致敏特征。
　　方法：选用雌性，体质量18～20 g的Balb/c小鼠。依照如下研究方法进行给药和观察。
　　Ⅰ型过敏反应，采用主动全身过敏试验(ASA)的方法，设定空白组、阳性药卵清蛋白(OVA)组和双黄连注射液临床剂量组，研究药物激发后小鼠全身过敏症状和全身皮肤血管通透性变化。
　　类过敏反应，根据双黄连注射液的临床给药方式（一次性静脉给药），以临床剂量为中心设置5个梯度给药剂量（以双黄连注射液生药量1g·m1-1为换算基础）即双黄连注射液5，10，20，40，60g·kg-1（相当于临床剂量0.5、1倍、2倍、4倍和6倍），观察给药60min内小鼠全身和局部的过敏症状、血清IgE、组胺含量变化、肠壁及肠系膜、皮肤血管通透性的改变等指标。
　　结果：主动全身过敏试验(ASA)的方法给药后，双黄连注射液组小鼠全身过敏症状评分结果为阴性，皮肤血管通透性未见明显变化。双黄连注射液一次性静脉给药后，高剂量（双黄连注射液40，60g·kg-1）组在给药短时间内小鼠即出现呼吸困难、眼眶水肿、眼角分泌物持续增多等严重过敏症状，与空白组比较肠壁及肠系膜、皮肤血管通透性均增加。各给药组小鼠血清IgE含量未发生显著性变化，血清组胺含量显著性升高。
　　结论：双黄连注射液的临床常见过敏类型为类过敏反应，这种过敏反应在首次给药后短时间内即可发生。
　　第二部分 双黄连注射液致敏标志物的研究
　　目的：对实验动物体内响应双黄连注射液促成过敏反应发生的可疑蛋白进行筛选。
　　方法：依照双黄连注射液体内致敏特征研究中类过敏模型的制作方法准备待检动物血清，将各给药组和空白组小鼠血清中蛋白成分进行聚类分析，利用TMT化学标记方法，Q-Exative液质联用平台对不同双黄连注射液剂量组的小鼠血清中蛋白成分进行相对定量检测。
　　结果：聚类分析结果显示各给药组与未给药组小鼠血清中相似蛋白聚类清晰，易于区分。共发现98种蛋白含量相对变化值＞1.5或＜0.67，且P＜0.05的可疑蛋白，免疫系统和免疫疾病相关的蛋白数量最多，共有10个。
　　结论：实验结果进一步验证了双黄连注射液类过敏反应发生与免疫系统具有紧密的关联性，体内存在对双黄连注射液进行响应并引起类过敏反应的蛋白，为进一步确定目标蛋白提供了较为可靠的依据。
　　第三部分 双黄连注射液致敏特征体外研究
　　目的：研究双黄连注射液（双黄连注射液）及其中间品（金银花连翘提取物、黄芩提取物）的不同浓度对RBL-2H3细胞增殖和形态的影响，研究双黄连注射液对RBL-2H3细胞凋亡和脱颗粒的影响。
　　方法：将双黄连注射液以体积比1∶16为初始浓度，按2倍梯度稀释至1∶4096作为受试样品。其中间品金银花、黄芩连翘提取物分别以体积比1∶8为初始浓度，按2倍梯度稀释至1∶2048作为受试样品。以各受试样品分别孵育RBL-2H3细胞，观察细胞形态变化。应用MTT比色法测定各组RBL-2H3细胞增殖活力，并计算细胞增殖的半数抑制浓度(IC50)。根据IC50设置不同给药浓度，观察了双黄连注射液对RBL-2H3细胞凋亡的影响，以Compound48/80为阳性药检测双黄连注射液对RBL-2H3细胞β-氨基己糖苷酶释放的影响情况。
　　结果：随着给药浓度的升高，双黄连注射液及其中间品对细胞增殖的抑制作用逐渐增强，细胞存活力明显降低，细胞损伤逐渐加重，细胞形态发生明显变化。随着双黄连注射液给药浓度的升高细胞凋亡情况逐渐加深，胞外β-氨基己糖苷酶含量降低，并经测算得到双黄连注射液及中间品的IC50。
　　结论：高剂量双黄连注射液对RBL-2H3细胞增殖存在一定影响，双黄连注射液并不能直接促进RBL-2H3细胞脱颗粒。为双黄连注射液类过敏细胞模型的建立、评价双黄连注射液及中间品的安全性及药物质量控制提供实验依据。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 研究背景与意义

1．2 研究现状

1．2．1 过敏反应原理概述

1．2．2 肥大细胞研究概况

1．2．3 蛋白质组学技术在中药注射剂过敏研究中的应用

1．2．4 现有双黄连注射液过敏性的评价方法

1．2．5 双黄连注射液过敏特征研究中存在的问题

1．3 本文研究内容

1．4 章节安排

第2章 双黄连注射液致敏特征体内研究

2．1 引言

2．2 材料

2．2．1 动物

2．2．2 仪器

2．2．3 药物与试剂

2．3 方法

2．3．1 药品制备

2．3．2 小鼠I型过敏反应的研究

2．3．3 小鼠类过敏反应的研究

2．3．4 小鼠腘窝淋巴实验

2．3．5 统计学分析

2．4 实验结果与分析

2．4．1 小鼠I型过敏反应实验结果

2．4．2 小鼠类过敏反应实验结果

2．4．3 小鼠腘窝淋巴实验

2．5 小结

第3章 双黄连注射液致敏标志物的研究

3．1 引言

3．2 材料

3．2．1 动物

3．2．2 仪器

3．2．3 药物与试剂

3．3 方法

3．3．1 待检样本制备

3．3．2 血清去高丰度白蛋白

3．3．3 样品质检

3．3．4 TMT标记全蛋白

3．3．5 C18色谱柱样品分级

3．3．6 质谱检测

3．3．7 数据分析

3．4 实验结果与分析

3．4．1 样品质检结果

3．4．2 样品层次相似蛋白聚类分析结果

3．4．3 质谱定性和相对定量检测结果

3．5 小结

第4章 双黄连注射液致敏特征体外研究

4．1 引言

4．2 材料

4．2．1 细胞株

4．2．2 仪器

4．2．3 药物与试剂

4．3 方法

4．3．1 受试样品的配制

4．3．2 MTI检测细胞活力

4．3．3 细胞形态学观察

4．3．4 Annexin V／碘化丙啶(PI)双染检测细胞凋亡

4．3．5 β-氨基己糖苷酶的测定

4．3．6 统计学分析

4．4 实验结果与分析

4．4．1 双黄连注射液及其中间品对RBL-2H3细胞增殖的影响

4．4．2 双黄连注射液及其中间品对RBL-2H3细胞IC50的影响

4．4．3 双黄连注射液及其中间品对RBL-2H3细胞形态的影响

4．4．4 双黄连注射液对RBL-2H3细胞凋亡的影响

4．4．5 双黄连注射液刺激RBL-2H3细胞后β-氨基己糖苷酶含量

4．5 小结

第5章 总结与展望

5．1 研究工作总结

5．2 未来研究展望

参考文献

致谢

文献综述 小鼠过敏反应动物模型的造模方法评述

参加的科研项目

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