抗氧化剂对辐射诱导小鼠造血系统损伤的防护作用及机制研究

摘要

本文主要从以下几部分进行论述：
　　第一部分 虾青素对辐射诱导小鼠造血系统损伤的防护作用
　　目的：电离辐射通过直接作用和间接作用对机体造成损伤，直接作用是电离辐射产生的巨大能量直接作用于生物大分子造成损伤，间接作用是电离辐射首先使机体内的水分子电离产生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，造成生物大分子和生物膜的损伤。造血系统对电离辐射特别敏感，骨髓造血抑制是机体受到全身照射(total body irradiation，TBI)后的临床表现之一。虾青素(Astaxanthin，ATX)是一种低毒、强效的天然抗氧化剂，可以有效的清除ROS。本研究旨在探讨虾青素对骨髓造血系统辐射损伤的作用。
　　方法：将C57BL/6小鼠分为对照组、4Gy照射组和4Gy照射+25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg三种浓度虾青素给药组，用血细胞计数仪计数外周血及骨髓细胞数目，初步研究虾青素的最佳给药浓度。利用4Gy或6Gy全身照射形成造血系统辐射损伤小鼠模型，将C57BL/6小鼠随机分为对照组、ATX组、TBI组和TBI+ATX组，照射前给药3天，照射后继续给药7天，照射后第12天或60天检测ATX对急性和持久性造血系统辐射损伤的作用。用血细胞计数仪计数外周血细胞和骨髓细胞数目;用流式细胞仪检测造血祖细胞和造血干细胞的比例、细胞内ROS含量、DNA损伤、细胞凋亡、NRF2相关蛋白及线粒体内外细胞色素C的表达;用免疫荧光染色检测细胞内NRF2水平;蛋白质印迹分析用于评估细胞内NRF2及凋亡相关蛋白的表达;酶活性测定试剂盒用于检测SOD、CAT和GPX1的酶活性;CFU-GM和骨髓竞争性移植实验用于检测造血祖细胞增殖能力和造血干细胞自我更新能力。
　　结果：与25mg/kg和100mg/kg虾青素给药浓度相比，50mg/kg虾青素可以显著提高受照后下降的外周血及骨髓细胞数目，辐射防护效果最好。此外，与单纯照射组相比，给予虾青素可以提高急性和持久性造血损伤小鼠的外周血和骨髓造血细胞数目，增强造血干、祖细胞的自我更新及增殖能力，起到辐射防护作用。虾青素可能通过降低骨髓造血细胞内ROS、DNA损伤和凋亡起到防护作用，这些变化与激活NRF2通路和调节凋亡相关蛋白表达有关。
　　结论：虾青素通过降低电离辐射引起的ROS和细胞凋亡对小鼠造血系统急性及持久性损伤起到防护作用，为开发新的低毒高效的辐射防护候选药研究提供依据。
　　第二部分 富氢水对小鼠造血干细胞辐射损伤的防护作用
　　目的：电离辐射对机体的损伤主要是通过间接作用使机体内的水分子电离产生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，造成细胞DNA双链断裂和氧化损伤。造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)对全身照射(total body irradiation，TBI)产生的ROS高度敏感，骨髓造血功能抑制是造血系统辐射损伤的临床表现之一，目前缺乏安全有效的治疗措施。富氢水(hydrogen-rich water,HW)是富含高浓度H2的液体，可特异性与自由基中氧化性能最强的羟自由基(·OH)反应起到抗氧化作用。本研究旨在探索富氢水对辐射诱导小鼠HSCs损伤的防护作用及作用机制。
　　方法：利用4Gy全身照射形成小鼠造血系统辐射损伤模型，将C57BL/6小鼠随机分为四组：对照组(Control)、富氢水给药组(HW)、4Gy全身照射组(TBI)和4Gy照射给药组(TBI+HW)，照射前10min灌胃富氢水，照射后继续给予富氢水7天。照射后第15天处死小鼠，用血细胞计数仪计数外周血细胞数目和骨髓细胞数目;用流式细胞仪检测造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells，HPCs)和HSCs的比例、细胞内ROS含量、细胞周期、细胞凋亡和NRF2相关蛋白的表达;用免疫荧光染色检测细胞内γ-H2AX和8-oxoG水平;用蛋白质印迹分析评估周期相关蛋白P21的表达;用酶活性测定试剂盒检测SOD、GPX和·OH活性;用CFU-GM实验检测HPCs的增殖能力，用骨髓竞争性移植实验检测HSCs的自我更新能力。
　　结果：富氢水可以提高受致死剂量照射小鼠的30天生存率;给予富氢水治疗后与4Gy全身照射前比较可以提高外周血细胞数目，改善白细胞分化偏倚损伤;使单侧股骨骨髓细胞数目提高35.4％;CFU-GM实验显示富氢水使受照后HPCs克隆形成能力提高47.8％;骨髓移植实验显示富氢水使造血干细胞的自我更新能力有所提高。富氢水的辐射防护作用可能与清除造血干细胞内过量ROS、调节细胞周期进程和减少造血干细胞凋亡密切相关。富氢水的防护机制与增强NRF2信号通路和下游抗氧化蛋白的表达以及调节凋亡相关蛋白表达有关。
　　结论：富氢水通过降低辐射致造血干细胞氧化应激、减少细胞周期阻滞和细胞凋亡减轻辐射诱导的急性造血损伤，为开发辐射防护剂研究提供理论依据。

目录

论文说明

第一部分 虾青素对辐射诱导小鼠造血系统损伤的防护作用

技术路线

摘要

前言

实验材料

3 主要试剂

4 主要溶液配制

5 抗体

6 主要仪器设备

实验方法

4 外周血检测

5 骨髓细胞相关检测

6 磁珠法富集骨髓c-kit+细胞及相关检测

7 全骨髓细胞移植实验及外周血嵌合率分析

8 粒细胞巨噬细胞克隆形成实验(Colony forming unit of granuloeyte macrophage cells，CFU-GM)

9 数据分析

实验结果

1 虾青素适宜给药浓度研究

2 虾青素对不同照射剂量致辐射损伤的防护作用

3 虾青素对辐射引起的小鼠骨髓长期损伤的防护作用

4 虾青素辐射防护作用的作用机制

讨论

小结

参考文献

第二部分 富氢水对小鼠造血干细胞辐射损伤的防护作用

技术路线

摘要

前言

实验材料

5 抗体

6 主要仪器设备

实验方法

5 外周血白细胞分型检测

6 骨髓细胞分类计数

7 ROS检测

8 羟自由基(·OH)和抗氧化酶活性检测方法

9 流式检测

10 细胞凋亡检测

11 CFU-GM实验

12 骨髓竞争性移植实验

14 体外实验

15 蛋白检测

16 免疫荧光

17 数据分析

实验结果与分析

1 富氢水对致死照射小鼠生存率的影响

2 富氢水缓解辐射造成的外周血细胞损伤和分化偏倚

3．富氢水增加受照小鼠骨髓细胞(BMCs)数目

4．富氢水提高小鼠受照射后骨髓细胞自我更新及增殖能力

5．富氢水降低受照小鼠c-kit+细胞中·OH水平

6．富氢水对受照小鼠c-kit+细胞细胞周期和凋亡的作用

7．富氢水减少受照小鼠c-kit+细胞的DNA损伤

8．富氢水上调抗氧化蛋白的表达

9．富氢水对增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

10．富氢水降低体外培养的c-kit+细胞内受照后增加的ROS和DNA损伤

讨论

小结

参考文献

缩略语表

综述 虾青素的生物学特性及其抗氧化作用机制研究进展

作者简介

致谢

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